氨基酸纸层析法

实验二 氨基酸纸层析法一、实验目的1、学习并了解分配层析的原理；2、掌握纸层析法分离氨基酸的原理和步骤二、实验原理纸层析法（paper chroma to graphy）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术， 可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定纸层析法又称纸色谱法，是用滤纸为支 持物，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲 和力弱，因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相，有机溶剂是流动相溶剂由下向上 移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行 展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配由于它们的分配系数不同，不同氨 基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层 析点溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf 原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离在一定条件下某种物质的Rf值是常数Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、 温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变， Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的 Rf 值相同或相近，此时如只用一种溶剂展 层，就不能将它们分开。

为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90 度，再用另一溶剂展 层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用所有氨 基酸及具有游离a氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸 与茚三酮反应产生（亮）黄色物质三、药品器材1 实验器材滤纸、烧杯10ml（X1）、剪刀、层析缸（X2）、毛细血管、电吹风（XI）2 实验试剂（1） 氨基酸溶液：赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸溶液以及他们的混合溶液（2） 溶剂系统碱相溶剂：V[正丁醇（A.R.） ]:V（12%氨水）:V（95%乙醇）=13:3:3酸性溶剂：V[正丁醇（A.R. ） ]:V（80% 甲酸）:V（ 水）=15:3:2⑶显色贮备液:V（0.4mol/茚三酮-异丙醇）:V （甲酸）:V（水）=20:l:5.四、实验方法1. 滤纸准备：选用新华1号滤纸，裁成24cmX 28cm的长方形，在距纸一端2cm处用铅 笔轻轻划一基线，在线上每隔3cm，画一小点样的原点2•点样：氨基酸点样量以每种氨基酸含5-20ug为宜，用微量注射器或微量吸管，吸取 氨基酸样品10ul点于原点（分批点完），用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复2〜3 次，点子直径不能超过 0.5cm。

3. 展层和显色：将点好样的滤纸，用白线缝好，制成圆筒，原点在下端，浸立在培养皿内，不需平衡，立即展层，展层剂为酸性溶剂系统[V（正丁醇）：V（甲酸）：V（水）=15:3:2],把展层剂混匀，倒入培养皿内，同时加入显色贮备液每10ml展层剂 加0.1-0.5ml的显色贮备液）进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿1-2cm时4. 显色：展层毕，取出滤纸，用热风吹干，蓝紫色斑点即显现5. 结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之 间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 R f 值，与标准氨基酸的 Rf 值对 照，确定混合物中含有哪些氨基酸五、实验结果六、问题与讨论1．纸层析法的原理是什么？ 纸层析法依据极性相似相溶原理，是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶 剂作为流动相由于样品中各物质分配系数不同，因而扩散速度不同，从而达到分离 的目的同时，运用茚三酮显色反应达到分离、鉴定氨基酸的目的2. 何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？试样经层析后可用比移值（Rf ）表示各组成成分的位置（比移值=原点中心至色 谱斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离之比），在一定条件下某种物质的Rf 值是常数。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和 质量等因素有关只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，Rf值是常数，故可根据Rf值 作定性判断。