三细胞工程基本技术课件
基本技术u实验室条件 u无菌技术u 显微技术u细胞观察与分析u细胞分离u细胞保存与复苏第1页/共115页实验室基本组成u细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养第2页/共115页基本实验室u准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作要求宽敞明亮，通风条件好u接种室：接种室的功能是进行无菌操作要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定接种室除了出入口和通气口外，应行密闭u培养室：培养室的功能是对离体材料进行控制培养其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁第3页/共115页辅助实验室u细胞学实验室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染u摄影室及暗室：其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印在有条件的情况下可建立此实验室u生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查第4页/共115页实验室布局的基本要求u便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。
第5页/共115页实验用品及主要设备u玻璃器皿u常用器械u细胞培养的主要设备第6页/共115页玻璃器皿u液体储存瓶u吸管u离心管u培养皿u培养瓶与培养板u其它器皿1第7页/共115页常用器械u解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精灯等第8页/共115页胞培养的主要设备u基本设备：冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器u灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯u无菌操作设备：净化工作台、接种箱u光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器u细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等u细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、倒置显微镜等u u 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等第9页/共115页无菌技术u 无菌技术是一个技术体系，涉及多方无菌技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，只有诸因素和环节面因素、多个环节，只有诸因素和环节都处理好，才能达到无菌都处理好，才能达到无菌u 培养基培养基u 器皿材料器皿材料u 接种工具接种工具u 操作环境操作环境u 培养室培养室u 工作台面工作台面u 具体的灭菌方法有多种具体的灭菌方法有多种u 污染检测与控制污染检测与控制第10页/共115页玻璃器皿清洗u浸泡刷洗浸酸冲洗第11页/共115页无菌室无菌室u无菌操作室和无菌培养室无菌操作室和无菌培养室u要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流密闭，无空气对流第12页/共115页灭菌种类u物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌射线辐照灭菌、过滤灭菌u化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢）钠、次氯酸钙、过氧化氢）u抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。
素等抗生素抑制细菌、真菌等污染u根据灭菌对象选择不同的灭菌方法根据灭菌对象选择不同的灭菌方法第13页/共115页高温高压灭菌u原理：在原理：在121高温和高温和0.8kg/cm0.8kg/cm2 2-1.1kg/cm1.1kg/cm2 2的压力下，一般持续的压力下，一般持续15-2015-20分分钟后，就可杀死一切微生物的营养体及钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子u适用于器皿、工具、衣物和培养基适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌第14页/共115页干热灭菌法干热灭菌法u将物品放入烘箱，利用高温使微将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的u适用于玻璃器皿适用于玻璃器皿第15页/共115页射线灭菌u紫外光常用于培养室和接种箱或超紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌操作前开灯净台的灭菌操作前开灯2020分钟可达到分钟可达到灭菌效果灭菌效果第16页/共115页过滤灭菌u原理：将带菌的液体或气体通过孔径小原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于于0.45uM0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。
到除菌目的u常用于不能以高温高压灭菌的培养液、常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌有机物质溶液和酶液的除菌u组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好滤器，它清洗方便，过滤效果好第17页/共115页蒸灭菌u用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌适用于无菌室的定期灭菌u常用的方法是将甲醛和高锰酸钾常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好效果较好第18页/共115页消毒液灭菌u 依化学灭菌剂的不同而适用于不依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌同场合的灭菌u70%70%酒精几乎适用于组织培养中如各酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等；工作台、操作人员的手等；u升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌用于培养材料的灭菌第19页/共115页室内灭菌室内灭菌u 2%2%的新洁尔灭擦洗，的新洁尔灭擦洗，u 70%70%乙醇喷雾，乙醇喷雾，u 紫外灯照射约紫外灯照射约2020分钟分钟u定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸第20页/共115页试剂和器皿的灭菌试剂和器皿的灭菌u包括培养基、特殊药品和所有无菌操作包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌使用的器皿的灭菌u培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌菌进行灭菌第21页/共115页污染检测与控制污染检测与控制u细菌：可采用抗生素预防u真菌：可采用抗真菌剂防治u支原体：可采用抗生素、加温处理（41）、使用支原体特异性血清u病毒：脱毒u细胞交叉污染：严格操作规程第22页/共115页显微技术u显微观察技术：u显微操作技术：借助显微操作仪采用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等可进行细胞解剖、物质的抽取及注入、移植等操作。
第23页/共115页细胞观察与分析u细胞计数与活力分析u细胞固定与染色观察u凋亡细胞观察u染色体分析第24页/共115页细胞计数与活力分析u采用血细胞计数法计数u活力分析：台盼蓝染色法：死细胞着色 MTT：活细胞使其还原为兰色，用酶标仪测定490nm 处的光密度，计算细胞相对活力 第25页/共115页血球计数板第26页/共115页计数法第27页/共115页细胞固定与染色观察u细胞固定甲醇-醋酸FAACarnoyu细胞染色苏木精-伊红（H.E)染色法Giemsa染色法Feulgen染色法考马斯蓝染色法免疫荧光法免疫过氧化物酶染色法第28页/共115页凋亡细胞观察u形态观察:u生化分析:锚定蛋白:检测凋亡早期PI:检测晚期或死细胞u分子技术:梯形电泳图谱第29页/共115页PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面 第30页/共115页FITC-AnnexinV染色第31页/共115页FITC-AnnexinV和PI染色第32页/共115页梯形电泳图谱第33页/共115页染色体分析u样品处理:秋水仙素u低渗处理u固定化u染色观察第34页/共115页细胞分离u细胞初步分离差速离心分离法u 单个细胞的获得 软琼脂培养法 和 有限稀释法 显微操作分离法 流式细胞仪分离 激光捕获显微切割 免疫磁珠分离 第35页/共115页细胞保存与复苏u目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法预保留细胞经消化分散后，加入冷冻保护液，同时将细胞悬液稀释按1ml/安瓿分装细胞悬液，在火焰下将安瓿封口。
将封口的安瓿放入慢冻机内，按1/min的速度缓慢冷冻，使温度降至-25冻结好的安瓿放入CO2低温冰柜或液氮罐中，温度达-150-190 如果需要复苏，可将安瓿取出后立即放入37 水浴中，使其快速融化第36页/共115页思考题u植物组织培养的基本实验室有哪些？实验室布局的基本要求是什么？u消毒灭菌种类有哪几类？u使用高压锅的基本步骤是什么？u用血球计数板进行计数时，细胞数/L=N*25/5*10*106*稀释倍数，N指什么？u对细胞进行染色体分析中，样品处理时加秋水仙素起什么作用？u简述细胞低温冷冻保存的方法第37页/共115页第三章、细胞工程基本技术第38页/共115页基本技术u实验室条件 u无菌技术u 显微技术u细胞观察与分析u细胞分离u细胞保存与复苏第39页/共115页实验室条件 u实验室基本组成u实验用品及主要设备第40页/共115页实验室基本组成u细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养第41页/共115页基本实验室u准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作要求宽敞明亮，通风条件好u接种室：接种室的功能是进行无菌操作。
要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定接种室除了出入口和通气口外，应行密闭u培养室：培养室的功能是对离体材料进行控制培养其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁第42页/共115页辅助实验室u细胞学实验室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染u摄影室及暗室：其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印在有条件的情况下可建立此实验室u生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查第43页/共115页实验室布局的基本要求u便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察第44页/共115页实验用品及主要设备u玻璃器皿u常用器械u细胞培养的主要设备第45页/共115页玻璃器皿u液体储存瓶u吸管u离心管u培养皿u培养瓶与培养板u其它第46页/共115页培养器皿1第47页/共115页培养器皿2第48页/共115页常用器械u解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精灯等第49页/共115页常用器械第50页/共115页细胞培养的主要设备u基本设备：冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。
u灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯u无菌操作设备：净化工作台、接种箱u光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器u细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等u细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、倒置显微镜等u u 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等第51页/共115页电子天平 第52页/共115页酸度计 第53页/共115页不锈钢蒸馏水器第54页/共115页双重蒸馏水器第55页/共115页磁力搅拌器第56页/共115页灭菌锅第57页/共115页灭菌锅 第58页/共115页烘箱第59页/共115页过滤灭菌装置第60页/共115页紫外灯 第61页/共115页超净工作台 第62页/共115页培养架 第63页/共115页光照培养箱 第64页/共115页摇床第65页/共115页生物反应器1第66页/共115页生物反应器2第67页/共115页植物细胞培养反应器第68页/共115页显微镜第69页/共115页无菌技术u 无菌技术是一个技术体系，涉及多方无菌技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，只有诸因素和环节面因素、多个环节，只有诸因素和环节都处理好，才能达到无菌。
都处理好，才能达到无菌u 培养基培养基u 器皿材料器皿材料u 接种工具接种工具u 操作环境操作环境u 培养室培养室u 工作台面工作台面u 具体的灭菌方法有多种具体的灭菌方法有多种u 污染检测与控制污染检测与控制第70页/共115页玻璃器皿清洗u浸泡刷洗浸酸冲洗第71页/共115页常用器械第72页/共115页无菌室无菌室u无菌操作室和无菌培养室无菌操作室和无菌培养室u要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流密闭，无空气对流第73页/共115页培养室1第74页/共115页培养室2第75页/共115页工作台面第76页/共115页灭菌种类u物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌射线辐照灭菌、过滤灭菌u化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢）钠、次氯酸钙、过氧化氢）u抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。
素等抗生素抑制细菌、真菌等污染u根据灭菌对象选择不同的灭菌方法根据灭菌对象选择不同的灭菌方法第77页/共115页高温高压灭菌u原理：在原理：在121高温和高温和0.8kg/cm0.8kg/cm2 2-1.1kg/cm1.1kg/cm2 2的压力下，一般持续的压力下，一般持续15-2015-20分分钟后，就可杀死一切微生物的营养体及钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子u适用于器皿、工具、衣物和培养基适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌第78页/共115页干热灭菌法干热灭菌法u将物品放入烘箱，利用高温使微将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的u适用于玻璃器皿适用于玻璃器皿第79页/共115页烘箱第80页/共115页射线灭菌u紫外光常用于培养室和接种箱或超紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌操作前开灯净台的灭菌操作前开灯2020分钟可达到分钟可达到灭菌效果灭菌效果第81页/共115页过滤灭菌u原理：将带菌的液体或气体通过孔径小原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于于0.45uM0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。
到除菌目的u常用于不能以高温高压灭菌的培养液、常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌有机物质溶液和酶液的除菌u组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好滤器，它清洗方便，过滤效果好第82页/共115页过滤除菌装置第83页/共115页熏蒸灭菌u用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌适用于无菌室的定期灭菌u常用的方法是将甲醛和高锰酸钾常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好效果较好第84页/共115页消毒液灭菌u 依化学灭菌剂的不同而适用于不依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌同场合的灭菌u70%70%酒精几乎适用于组织培养中如各酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等；工作台、操作人员的手等；u升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌。
用于培养材料的灭菌第85页/共115页室内灭菌室内灭菌u 2%2%的新洁尔灭擦洗，的新洁尔灭擦洗，u 70%70%乙醇喷雾，乙醇喷雾，u 紫外灯照射约紫外灯照射约2020分钟分钟u定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸第86页/共115页试剂和器皿的灭菌试剂和器皿的灭菌u包括培养基、特殊药品和所有无菌操作包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌使用的器皿的灭菌u培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌菌进行灭菌第87页/共115页灭菌锅种类灭菌锅种类u u立式、卧式和手提式立式、卧式和手提式u操作步骤：加水操作步骤：加水 装料装料 密封密封 排气排气 升压升压 灭菌灭菌 降压降压 取物品取物品 放水放水第88页/共115页污染检测与控制污染检测与控制u细菌：可采用抗生素预防u真菌：可采用抗真菌剂防治u支原体：可采用抗生素、加温处理（41）、使用支原体特异性血清u病毒：脱毒u细胞交叉污染：严格操作规程第89页/共115页显微技术u显微观察技术：u显微操作技术：借助显微操作仪采用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等可进行细胞解剖、物质的抽取及注入、移植等操作。
第90页/共115页显微操作仪1第91页/共115页显微操作仪2第92页/共115页细胞观察与分析u细胞计数与活力分析u细胞固定与染色观察u凋亡细胞观察u染色体分析第93页/共115页细胞计数与活力分析u采用血细胞计数法计数u活力分析：台盼蓝染色法：死细胞着色 MTT：活细胞使其还原为兰色，用酶标仪测定490nm 处的光密度，计算细胞相对活力 第94页/共115页血球计数板第95页/共115页计数法第96页/共115页细胞固定与染色观察u细胞固定甲醇-醋酸FAACarnoyu细胞染色苏木精-伊红（H.E)染色法Giemsa染色法Feulgen染色法考马斯蓝染色法免疫荧光法免疫过氧化物酶染色法第97页/共115页凋亡细胞观察u形态观察:u生化分析:锚定蛋白:检测凋亡早期PI:检测晚期或死细胞u分子技术:梯形电泳图谱第98页/共115页形态观察第99页/共115页PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面 第100页/共115页FITC-AnnexinV染色第101页/共115页FITC-AnnexinV和PI染色第102页/共115页梯形电泳图谱第103页/共115页染色体分析u样品处理:秋水仙素u低渗处理u固定化u染色观察第104页/共115页细胞分离u细胞初步分离差速离心分离法u 单个细胞的获得 软琼脂培养法 和 有限稀释法 显微操作分离法 流式细胞仪分离 激光捕获显微切割 免疫磁珠分离 第105页/共115页琼脂平板培养第106页/共115页琼脂平板琼脂平板（培养培养淋球菌）第107页/共115页多孔板培养第108页/共115页流式细胞仪原理第109页/共115页第110页/共115页激光捕获显微切割第111页/共115页第112页/共115页免疫磁珠分离第113页/共115页细胞保存与复苏u目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法预保留细胞经消化分散后，加入冷冻保护液，同时将细胞悬液稀释按1ml/安瓿分装细胞悬液，在火焰下将安瓿封口。
将封口的安瓿放入慢冻机内，按1/min的速度缓慢冷冻，使温度降至-25冻结好的安瓿放入CO2低温冰柜或液氮罐中，温度达-150-190 如果需要复苏，可将安瓿取出后立即放入37 水浴中，使其快速融化第114页/共115页思考题u植物组织培养的基本实验室有哪些？实验室布局的基本要求是什么？u消毒灭菌种类有哪几类？u使用高压锅的基本步骤是什么？u用血球计数板进行计数时，细胞数/L=N*25/5*10*106*稀释倍数，N指什么？u对细胞进行染色体分析中，样品处理时加秋水仙素起什么作用？u简述细胞低温冷冻保存的方法第115页/共115页。
