第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,,,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,,*,第十三章免疫细胞分离及表面标志检测Ppt,第十三章免疫细胞分离及表面标志检测Ppt,1,免疫细胞的分离及检测,※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定,※方法：体外法为主,※目的：判断机体免疫状态,※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效,免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或,组织中分离出来,,2,免疫细胞的分离及检测※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能,,第一节 免疫细胞的分离,外周血单个核细胞分离,淋巴细胞的分离,T细胞和B细胞的分离,T细胞亚群的分离,,,第一节 免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离,3,细胞分离基本原理,不同细胞密度不同,不同细胞生物学特性不同,不同细胞表面分化抗原不同,,,细胞分离基本原理不同细胞密度不同,4,,,一、外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞,（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）,包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。

聚蔗糖-泛影葡胺,聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒,,,一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞（peripher,5,原理外周血中各细胞的比重不同，PBMC的比重为1.075～1.090，红细胞和多核细胞分别为1.093和1.092，选择比重为1.077±0.001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于 Ficoll分离液上层原理外周血中各细胞的比重不同，PBMC的比重为1.075～1,6,用1.077±0.001的分层液可分离人外周血单个核细胞,Ficoll分离液,２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液,１份34%泛影葡胺生理盐水溶液,,(,聚蔗糖-泛影葡胺,）,,Ficoll,,外周血,,,用1.077±0.001的分层液可分离人外周血单个核细胞,7,对分离介质的要求：对细胞无毒；,等渗；,与血浆和分离细胞不相溶；,有特定的比重不同动物的PBMC比重有差异：小鼠：1.085,大鼠：1.087,人： 1.075～1.090,,,对分离介质的要求：对细胞无毒；不同动物的PBMC比重有差异：,8,方法学评价：分离得到的PBMC纯度可达９５％，,淋巴细胞占９０％～９５％；,操作简便；,易于无菌。

方法学评价：分离得到的PBMC纯度可达９５％，,9,二 、淋巴细胞分离,贴壁粘附法,吸附柱过滤法,Percoll 分离液法,（连续密度梯度离心）,,,二 、淋巴细胞分离贴壁粘附法,10,不同细胞生物学特性不同,人： 1.,四、细胞表面标志检测的意义,对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测help T cell,Th）,CD4+CD25+调节性T细胞,对保存液的要求等渗，具pH 缓冲作用，并对细胞无毒性（Hanks、Tc199、RPMI 1640 ）死细胞着色，染成蓝色；,利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G10的层析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞Percoll 分离液法,与血浆和分离细胞不相溶；,死细胞着色，染成蓝色；,外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）五、分离细胞的保存和活力检测,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37℃温箱静置1 h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞(无活性）1.贴壁黏附法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PBMC,37℃ °1 hour,上清液,,,,,,,,,,,,,,,,单核,单核,淋巴细胞,注意：B细胞也可粘附,,,不同细胞生物学特性不同 利用单核细胞具有贴壁生长的特点，,11,利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G10的层析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞2. 吸附柱过滤法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PBMC,,,,,,,,,,,,洗 脱,,,,,,,,,,,,洗脱液,淋巴细胞,单核细胞 > DC > B细胞 > T细胞,细胞的粘附能力：,,,利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入,12,3. Percoll 分离液法,Percoll 是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。

采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll 液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化死细胞 血小板,单核细胞,淋巴细胞,粒细胞,红细胞,,,3. Percoll 分离液法Percoll 是一种经聚乙烯,13,三、T、B细胞和T细胞亚群的分离,磁性微球分离法,荧光激活细胞分离仪分离法,,,,三、T、B细胞和T细胞亚群的分离磁性微球分离法,14,1. 磁性微球分离法,磁性微球：金属小颗粒（Fe,2,o,3,, Fe,3,o,4,)，其表面包裹有高分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基团（氨基、羧基和羟基），可结合生物大分子物质（抗原，抗体，核酸等）免疫磁珠：微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠1. 磁性微球分离法磁性微球：金属小颗粒（Fe2o3, Fe,15,,,第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt课件,16,一、外周血单个核细胞分离,用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着色的细胞，计数200 个细胞，以不着色细胞的百分率即代表细胞的活力外周血单个核细胞分离,CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞,001的分层液可分离人外周血单个核细胞,易于无菌。

第一节 免疫细胞的分离,聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒,CD19（B细胞的标志）,１份34%泛影葡胺生理盐水溶液,CD35（C3b/C4b受体）,死细胞着色，染成蓝色；,001的分层液可分离人外周血单个核细胞,不同细胞生物学特性不同,092，选择比重为1.,（cytotoxic T cell,Tc or CTL）,２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液,※目的：判断机体免疫状态,不同细胞生物学特性不同,,,,一、外周血单个核细胞分离,17,流式细胞分析仪,2 .荧光激活细胞分离仪分离法,,,流式细胞分析仪2 .荧光激活细胞分离仪分离法,18,,E花环沉降法,尼龙毛柱分离法,T细胞和B细胞的分离,,,E花环沉降法 T细胞和B细胞的分离,19,1. E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）,,,,,,,,,,B 细胞,T 细胞,Ficoll液离心,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,溶解红细胞,T细胞,B细胞,,,1. E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）B 细胞,20,2. 尼龙毛柱分离法,此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上2. 尼龙毛柱分离法此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性,21,,,,第十三章免疫细胞分离及表面标志检测ppt课件,22,四、不同细胞分离方法的综合评价,早期,,细胞物理属性,细胞生物属性,,分辨率和灵敏度不高,现在（根据细胞表面标志）,,免疫磁珠,流式细胞仪,,,分辨率和灵敏度高,缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和仪器昂贵,,,四、不同细胞分离方法的综合评价早期细胞物理属性细胞生物属性分,23,五、分离细胞的保存和活力检测,1.分离细胞的保存,对保存液的要求等渗，具pH 缓冲作用，并对细胞无毒性（Hanks、Tc199、RPMI 1640 ）。

如需短期保存，置4℃放置较好，可减低细胞代谢活动如需长期保存，应放入液氮罐中在深低温(196℃)条件下保存细胞五、分离细胞的保存和活力检测1.分离细胞的保存,24,CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞,淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标淋巴细胞占９０％～９５％；,与血浆和分离细胞不相溶；,※目的：判断机体免疫状态,CD19（B细胞的标志）,四、细胞表面标志检测的意义,对分离介质的要求：对细胞无毒；,第十三章免疫细胞分离及表面标志检测Ppt,CD19（B细胞的标志）,092，选择比重为1.,不同细胞生物学特性不同,此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上与血浆和分离细胞不相溶；,荧光激活细胞分离仪分离法,Percoll 分离液法,死细胞着色，染成蓝色；,有特定的比重聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒,２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液,CD3+CD4+CD8辅助性T细胞,2 .细胞活力测定,细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力的测定常用的简便方法是台盼蓝(trypan blue)染色法死细胞着色，染成蓝色；活细胞拒染用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着色的细胞，计数200 个细胞，以不着色细胞的百分率即代表细胞的活力。

CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞2 .细胞活力测定,25,一、T,细胞表面标志的检测,二、B,细胞表面标志的检测,四、细胞表面标志检测的意义,,三、自然杀伤细胞表面标志的检测,,,第二节 淋巴细胞标志及亚群分类,,,一、T细胞表面标志的检测二、B细胞表面标志的检测四、细胞表面,26,,,一、T细胞表面标志及其亚群,CD3+CD4+CD8辅助性T细胞,（help T cell,Th）,CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞,（cytotoxic T cell,Tc or CTL）,CD4+CD25+调节性T细胞,（regulatory T cell,Tr or Treg）,,,一、T细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8辅助性T细,27,,,二、B细胞表面标志,,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标CD19/CD5分子可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞二、B细胞表面标志 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受,28,CD19,+,CD5,-,:B2细胞,SmIg：膜表面免疫球蛋白,CD19（B细胞的标志）,CD21,CD32(FcRⅡ),CD35（C3b/C4b受体）,CD40（成熟B细胞）,CD80/86（活化的B细胞）,,CD19,+,CD5,+,,:B1细胞,CD22 和CD23,,二、B细胞表面标志,,,,CD19+CD5-:B2细胞SmIg：膜表面免疫球蛋白CD1,29,,,三、NK细胞表面标志,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。

三、NK细胞表面标志 人类NK细胞表面标志主要以,30,,,淋巴细胞表面标志检测的临床意义,淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评价免,31,CD19/CD5分子可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞组织中分离出来,易于无菌与血浆和分离细胞不相溶；,CD35（C3b/C4b受体）,CD19（B细胞的标志）,四、细胞表面标志检测的意义,五、分离细胞的保存和活力检测,CD80/86（活化的B细胞）,１份34%泛影葡胺生理盐水溶液,五、分离细胞的保存和活力检测,Percoll 分离液法,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标不同动物的PBMC比重有差异：小鼠：1.,聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒,001的分层液可分离人外周血单个核细胞,CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞,不同细胞生物学特性不同,SmIg：膜表面免疫球蛋白,免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或,五、分离细胞的保存和活力检测,死细胞着色，染成蓝色；,聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒,利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G10的层析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。

T细胞和B细胞的分离,※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定,001的分层液可分离人外周血单个核细胞,一、T细胞表面标志及其亚群,大鼠：1.,现在（根据细胞表面标志）,CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞,细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力的测定常用的简便方法是台盼蓝(trypan blue)染色法２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液,不同细胞生物学特性不同,CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞,CD3+CD4+CD8辅助性T细胞,092，选择比重为1.,淋巴细胞表面标志检测的临床意义,CD40（成熟B细胞）,与血浆和分离细胞不相溶；,人： 1.,易于无菌与血浆和分离细胞不相溶；,三、NK细胞表面标志,四、不同细胞分离方法的综合评价,淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标Percoll 分离液法,荧光激活细胞分离仪分离法,四、不同细胞分离方法的综合评价,死细胞着色，染成蓝色；,细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力的测定常用的简便方法是台盼蓝(trypan blue)染色法CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞,易于无菌CD3+CD4CD8+细胞毒性T细胞,聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒,090，红细胞和多核细胞分别为1.,不同动物的PBMC比重有差异：小鼠：1.,橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞(无活性）。

CD3+CD4+CD8辅助性T细胞,第一节 免疫细胞的分离,,临床常见疾病中的,T,淋巴细胞的变化,,,CD19/CD5分子可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1,32,。