大肠杆菌电击转化流程

大肠杆菌感受态制备及电转化流程1.细菌电转化感受态细胞的制备准备：50mL离心管3个10%甘油＞200mL灭菌蒸馏水n100mL冰盒（50mL离心管预冷）2个1）由-80°C冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h晚上将新鲜的菌落接种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37C振荡培养过夜（约12h）,转速控制在200rpm;2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培养基的250mL三角瓶中，37C剧烈振荡（200rpm）培养至OD60°约为0.5〜0.6;3）将2瓶细菌培养物分别倒入两个预冷的50mL离心管,然后至于冰水混合物中骤冷,二定要骤冷，冰水混合物中冷却至少15min（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）3 ）将离心管于4C,4000rpm，离心10min，收集菌体，弃上清；4 ）用50ml灭菌蒸馏水（预冷至4C）轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体撚后把水加满，4C,4000rpm离心10min，弃上清，再重复一次；5 ）再用10%甘油重复步骤4）两次，4000rpm离心10min，最后一次倒尽上清后，再用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100pL/支（一般,25mL起始培养物最终用200-250pL10%甘油悬浮）；6 ）放入-80C冰箱中速冻。

或者立即用于电转化注意：1）菌种最好是-80C冻存的，活化后生长状态较好2 ）20ml培养过夜,振荡速度不要过高（一般应该是37C,300rpm,6h,当天转接,这样一天内工作量太大,这里我们选择过夜培养,时间长,转速控制在200rpm,可以适当缩短时间，前一天晚接种，第二天早转接）3）培养完毕后一定要骤冷，是培养物在短时间内迅速冷却冰水混合物中摇动瓶子，大约15min4）使用的器皿一点要非常干净，没有化学物质残存，可以先用餐洗净洗，再加入NaOH固体?□蒸馏水产热，最后用蒸馏水反复冲洗干净注意pH值检测5）培养完毕后的离心操作一定要低温所用的水禾□甘油，离心管都要冰上预冷6）整个过程尽量不要用枪吹打7 ）器皿禾和试剂最好最后用重蒸水涮洗和和配置8 ）控制好菌体的OD600值，收菌以半对数期合适，一般OD为0.5〜0.6最佳，过则不佳9 ）最后一次务必倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，一般每管仅剩200pL左右切勿用过多甘油也悬浮细胞，我曾用350-500pL10%的甘油/25mL出发菌液，导致细胞浓度下降，电转效率低2-3个数量级2电转化准备：冰盒、1.5mL离心管、电击杯、37弋的LB培养基1）将电击杯冰上预冷，冻存的感受态细胞取出冰上溶解2）在冰上,30pL感受态细胞加入1pL纯化的连接液（或者加入0.3-0.5未纯化的连接液）,冰上培育5min;3）将混合液加入预冷的电击杯（不要产生气泡），冰浴10min;4）然后电击（注意擦干杯外的水防止电火花），电击条件为2.5KV，200欧姆，25uF（我们用的是BioRad电转化仪，0.2电转化杯），时间常数应该在4.5-5ms之间（其值越大,说明感受态细胞中离子去除率越彻底。

电击（将电击杯推入电转化仪,按一下pulse键，听到蜂鸣声）Dopowt专利：klebisella200欧姆，2.5kv4-5ms，0.2电击杯，40pL细胞+1~2pLDNA）5）迅速加入1mL37°C保温的LB（电转完成后加入无抗性培养基的速度很重要，一般不能超过一分钟，否则效率大大降低）,将混合液吸出,转移到1・5mL的离心管中（此步有热击的作用，室温进行）6）37C,220-250rpm振荡培养1h,可适当延长时间，使其充分表达抗性7）涂板注意：1）电击之前保持低温状态2 ）连接液要纯化，去离子，ddH2O溶，或者加入O.3-O.5pL未纯化的连接液，切勿过多以免电火花，我曾经使用过0.3pL和0.6pL连接液的加入细胞做对比，转化效率相当3 ）原核生物受体细胞电击以15kw/cm场强为最佳，电击电压根据电击杯厚度选择4 ）电击杯使用完，用针头蒸馏水反复冲洗杯底，再用70%乙醇浸泡，4C存放，使用前烘干即可，或者烘干后，-20C冰箱存放5 ）37C振荡培养时间切勿过长,否则会有很多的卫星菌落禾□轻微的菌膜干扰我曾培养1h45min即出现上述卫星菌落和轻微的菌膜干扰电击杯的清洗流程清洗方法一：1. 用清水将电击杯稍冲一下2. 向电击杯中加入75%的酒精浸泡2h3. 弃去酒精，在用蒸馏水冲洗2-3遍，然后用1mL的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上4. 加入无水乙醇2mL于电击杯中浸泡30分钟5. 弃去无水乙醇，于通风橱内挥发干乙醇6•将清洗好的电击杯放入-20弋冰箱内待用7.不同样品使用的电击杯应分开；每周用1%酒精浸泡30分钟。

清洗方法二：1、第一次使用完后，立即对着自来水冲洗几次，然后放在泡有洗衣粉的瓶子里泡几个小时；2、然后用牙签裹住一薄层棉花深入到夹层里来回清洗两遍（彻底除去夹缝里残存的菌液）；3、用干净的容器装住电击杯，同时泡上单蒸水，在70度水浴一小时左右（让残余的DNA彻底变形）；4、倒去单蒸水之后，泡上70%的酒精；5、什么时候想用了，拿出来到超净台吹干。