牛乳中细菌数的检查

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同时，牛乳也是许多疾病传 播的一种重要的非生命载体，富含微生物生长繁殖的丰富营养［1］从健康母牛 体内刚取出的牛奶含有少量正常的起始微生物，在牛乳的采取、加工、分装与 运输过程中，可能由于操作不规范而使牛乳污染杂菌由于牛乳营养丰富，其 中污染的杂菌会快速繁殖，饮用后对身体有极大危害牛乳的细菌学检查一般有显微镜直接计数法、美蓝还原酶试验、检测大肠 菌群和标准平板计数法［2］，本次试验通过后两种方法分别定性、定量检测牛乳 样品的细菌数含量，同时通过对照试验，确定在牛乳消毒中被广泛应用的巴斯 德消毒法的卫生标准是否达标2材料与方法2.1试验时间与地点2011年11月7日-8日，9号楼522试验室2.2 试验材料材料：亚奥特鲜牛奶；亚奥特纯牛奶；牛肉膏蛋白胨培养基；试剂：美蓝溶液(1:250 000)；无菌水；蒸馏水等；仪器和用具：试管，试管架，三角瓶，5mL移液枪及枪头，1mL移液枪及枪 头，培养平板，高温蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅，微波炉，显微镜，载玻片，标 记笔等2.3试验方法2.3.1牛肉膏蛋白胨培养基和无菌水的制备与灭菌制备牛肉膏蛋白胨培养基400mL，分装在两个三角瓶中；取9支试管，每 支试管加9mL蒸馏水。

将牛肉膏蛋白胨培养基与装有蒸馏水的试管及21个平板 一起灭菌，121°C维持20min牛肉膏蛋白胨培养基的配方(每1000mL)为：牛肉膏3g，蛋白月东10g, NaCl5g，琼脂 4.4g，水 1000mL, pH=7.0~7.22.3.2美蓝还原酶试验法测定牛乳质量(1) 取三支无菌试管，标记为1号、2号和3号，1号试管加入10mL亚奥 特鲜牛奶，2号、3号试管分别加入10mL亚奥特纯牛奶，1号、2号试管分别加 入1mL美蓝溶液，分别加棉塞塞紧2) 轻轻摇动试管，置于37C水浴锅中温浴，记录开始时间；(3) 试管在水浴锅中稳定5min后取出，轻轻摇动后再放回水浴锅；(4) 每隔30min取出试管观察美蓝与牛乳混合液颜色变化，直至3-6h， 记录试管中牛乳4/5变白时的时间2.3.3巴氏消毒法消毒牛乳(1) 将亚奥特鲜牛奶摇匀，使其中的微生物充分混匀；(2) 取一支无菌试管，标记A，加亚奥特鲜牛奶5mL；(3) 将A试管置于80C水浴锅中，使水面超过试管内牛乳液面，保持 15min，不断摇动试管使加热均匀；(4) 加热至15min时立即取出试管，用流水冲洗试管外壁，使牛乳迅速冷 却；2.3.4标准平板计数法检测牛乳中细菌数(1) 将亚奥特鲜牛奶摇匀，使其中的微生物充分混匀；(2) 取一支无菌试管，标记B，加亚奥特鲜牛奶5mL；(3) 摇匀A、B试管中牛乳，从A试管中吸取1 mL牛乳用无菌水稀释，稀 释度依次为10-2，10-3，10-4；MB试管中吸取1mL牛乳用无菌水稀释，稀释 度依次为 10-3，10-4，10-5。

4) 取21个无菌平板并标明稀释度、溶液名称(消毒前牛乳、消毒后牛 乳和无菌水)，其中分别取不同梯度的牛乳各1 mL依次注入相应标记的平板， 每个梯度做三个平行；取无菌水1 mL注入平板，做三个平行；(5) 取出灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基，用微波炉熔化为液体，冷却到 45°C左右后摇匀，向21个平板中各加15mL，静置6) 待平板中培养基凝固后倒置，置于37C培养箱中培养24h；(7) 选择菌落数为30-300左右的平板计数，计算每毫升牛乳中细菌数3结果与分析3.1试验结果3.1.1美蓝还原酶试验法结果见表1表1美蓝还原酶试验法结果Table1 the results of methylene blue reductase test注：表格中“一一”表示无数据3.1.2标准平板计数法结果见表2表2标准平板计数法结果Table2 the results of the standard plate counting method注：表格中“——”表示未获得数据3.2 分析3.2.1美蓝还原试验法1号试管还原时间为95min，所以牛乳质量为“差”；2号试管还原时间为 185min，故牛乳质量为“中等”。

3号试管未加美蓝溶液，作为观察颜色变化 的对照3.2.2标准平板计数法1mL巴氏消毒法消毒之后的牛乳中根据三个梯度测得的细菌数为9833个 /mL说明生鲜牛乳必须经过巴斯德消毒后才可饮用未经消毒的牛乳未长菌 落，具体原因见讨论部分4讨论美蓝还原酶试验法和标准平板技术法是牛乳中细菌数检测中较为准确、直 观的方法其中，美蓝还原酶试验法可以定性检测牛乳质量其原理是，美蓝 作为一种氧化还原指示剂，可在厌氧条件下被还原为无色，如果牛乳中有细 菌，其中的活的好氧和兼性厌氧菌通过呼吸作用消耗氧气，造成牛乳中溶氧下 降，形成厌氧环境，氧化-还原点位降低，使美蓝还原为无色美蓝［3〜4］牛乳 中细菌数越多，呼吸作用越旺盛，消耗氧气越多，厌氧环境越严格，还原时间 越短，因此可依据还原时间的长短判断牛乳的质量等级目前通过美蓝还原法 检测牛乳质量的一般标准是：还原时间在30min之内的，质量为“很差”，为 四级奶；还原时间为30min-2h的，质量为“差”，为三级奶；还原时间为2- 6h的，质量为“中等”为二级奶；还原时间为6-8h的，质量为“好”为一级 奶［5］标准平板菌落计数法是测定细菌数的经典方法，可以定量检测牛乳中细菌 数量，从而直接判断牛乳质量。

该方法依据的原理是单个细菌在合适的培养条 件下可长成菌落，通过系列稀释使细菌浓度降低，并可以充分分散为单个细 菌，经合适培养后，每个细菌都长成肉眼可见的菌落待菌落长成后，通过统 计菌落数并计算每毫升牛乳中的细菌数，从而判断牛乳的质量我国消毒牛乳 的卫生标准是，用标准平板计数法检查，规定细菌总数小于30000个/mL［6］巴斯德消毒法是牛乳进行消毒普遍采用的方法，在牛乳分装之前消毒生 奶，确保细菌相对较少，能消灭牛奶中的病原菌和有害微生物，但不破坏牛奶 的营养成分，并保持其物理性质，多用于食品消毒，保持食品风味巴斯德消 毒法是一种温和的加热工艺，在实际应用中加热消毒的范围较广，一般在 63〜90°C之间视消毒时间而定，主要方法有：63°C保持30min，或者是80°C保持 15min，90°C保持5min本次试验即验证了该消毒方法的消毒效果，通过在 80C下保持15min然后用标准平板计数法检查细菌数，验证了巴斯德消毒法的 可靠性，也说明生鲜牛乳必须经过巴斯德消毒法才符合卫生标准的要求，才能 分装、饮用在本次试验中仍出现了一些问题，主要表现在以下方面：第一，在美蓝还原酶试验中，未验证美蓝溶液是否变质失效。

美蓝溶液变 质后可能会影响还原时间的长短，甚至无法测得实验数据第二，在美蓝还原酶试验中，检查美蓝是否变色的时间间隔设定为 30min，使得试验结果可能存在较大误差但缩短时间后，就意味着需要频繁取 出试管，对温水浴效果有影响根据本次试验的结果，在尽量缩小误差且不影 响温水浴效果的前提下，建议将时间间隔缩短为15min由于时间原因，本次 试验并未验证15min的时间间隔是否确实符合试验要求第三，在标准平板计数法测细菌数试验中，在试验设计初，没有设置空白 对照，即用血1无菌水代替消毒后和消毒前的牛乳，加15mL左右牛肉膏蛋白胨 培养基，在相同条件下培养，进行菌落计数只有通过空白对照试验，才能确 定无菌水、培养基、操作过程、操作中使用的仪器是否染菌，是否对试验结果 有影响根据严格的试验要求，应设置该对照试验，并且只有在对照组中严格 不长菌落的前提下才能确保整个操作过程属于无菌操作第四，在标准平板计数法测定细菌数试验中，在试验设计初，未消毒牛乳 细菌数测定时，每个稀释度牛乳稀释液的总量是5mL，使得后续操作中用移液 枪无法吸出1mL稀释液为确保试验有序进行，每个试管中稀释液总量应该是 10mL第五，在标准平板计数法测定细菌数试验中，消毒后的牛乳在进行计数时 发现平板上没有长菌。

培养平板不长菌的可能原因有：（1）培养基种类不适合 对应菌种的生长；（2）培养基配置过程中出现问题，如配料变质、配料用量错 误、没有调节合适的pH；（3）培养条件不适合菌种生长，如培养温度、培养 时间；（4）操作中酒精误入培养基，使菌种致死；（5）在加入培养基时，没 有冷却到45°C左右，培养基温度过高，导致菌种死亡；（6）含菌样品的问 题，比如样品无菌、样品细菌浓度低而稀释度过大在本次试验中可能成立的 原因为琼脂变质、pH调节不准确、加培养基时温度过高可以通过重复试验、 对照试验、显微镜检查来确定具体原因由于时间关系，本次试验未进一步确 定原因第六，在进行菌落计数前没有对培养平板进行拍照，使得试验数据可信度 降低对试验结果进行拍照，一方面可以保留试验初始数据，另一方面可以作 为试验结果存在的证明由于以上问题的存在，在严格意义上讲，本次试验是失败的通过对试验 数据的分析，可初步确定本次试验的试验结果是合理的，能够初步达到目的5结论美蓝还原酶试验法和标准平板技术法都可以用作牛乳中细菌数的检测美 蓝还原酶试验法操作简便，对仪器和设备要求低，出现结果所需时间短，可定 性检测牛乳质量标准平板计数法所需试验周期长，对仪器设备要求高，操作相对复杂，但 可以定量检测牛乳中细菌数目，而且可以设置多组平行，具有较高的重复性， 提高检测准确度。

牛乳因其富含蛋白质且容易吸收而被人们食用，但也正是因为牛乳营养丰 富，细菌极易大量繁殖，巴斯德消毒法是一种对牛乳消毒的可靠方法本次试 验也证明，生鲜牛乳必须经过巴斯德消毒才能确保牛乳中细菌数控制在国家卫 生标准范围内牛乳常用的消毒方法还有超高温瞬时杀菌法，实在湿热温度 135〜150°C时维持3~5s，在很短的时间内，牛奶的营养物质不会被破坏，但能 有效杀死微生物目前，针对牛乳中细菌的检测在美蓝还原酶试验法和标准平板计数法两种 经典方法的基础上又有研究人员设计出新的方法，如多重PCR检测技术在牛乳 细菌检测中的应用［7］同时，以牛乳为主要原料，通过接种保加利亚乳杆菌、 乳酸链球菌、嗜热链球菌等菌种，经发酵使牛乳中的蛋白质凝结成块而制成酸 乳，由于菌种迅速生长繁殖，菌体及其代谢产物大量增加，尤其是所含的乳酸 等有机酸可以改善肠道菌群，抑制致病菌的生长，还具有增强免疫、刺激肠胃 蠕动、阻碍对铅的吸收等功能［8］综上，牛乳制品的安全生产关系到国民体质与健康，对牛乳进行巴斯德消 毒法处理并进行细菌学检查十分必需同时研究新的、更加方便准确的检测方 法也是一个研究方向参考文献[1][2][5][6] [8]沈萍,陈向东.微生物学实验.北京:高等教育出版社，2007:215-278.[3] 周群英，高群耀.环境微生物学.北京:高等教育出版社,1998:188-196.[4] 周德庆.微生物学教程.北京:高等教育出版社,2005:362-368.[7]王华，刘斌.PCR技术在食品微生物学中的应用.生物技术通报,2010(2).。