乳制品羟脯氨酸含量测定方法

乳制品中L—羟脯氨酸含量的测定方法1 范围本方法为乳制品中L-羟脯氨酸的测定方法 本方法适用于乳制品中L-羟脯氨酸的测定3 引用标准GB 9695.23-2008 肉与肉制品 羟脯氨酸含量测定2 术语与定义乳制品中L-羟脯氨酸含量hydroxyproline content of foods在本方法规定的条件下测定的L-羟脯氨酸的含量L-羟脯氨酸含量用质量分数表示4 原理用硫酸于105°C水解试样，释放出L-羟脯氨酸L-羟脯氨酸经氯胺T氧化后，与对二甲 胺基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长 558nm 处进行比色测定L-羟脯氨酸存在于动物胶、骨胶原或动物的结缔组织中水解动物蛋白(HAP) (Hydrolyzed animal protein，中文别名：酶解胶原蛋白)中L-羟脯氨酸含量约为10%，对于 乳与乳制品本身组成成分中不存在L-羟脯氨酸，但产品标准中有氮、蛋白质或氨基酸含量的 规定的乳与乳制品，可通过本方法检测L-羟脯氨酸的含量并推算出动物水解蛋白的大体含量， 可鉴别检验样品是否添加动物水解蛋白，以及动物水解蛋白的大体含量 通过4 试剂如无特别说明，所用试剂均为分析纯水为蒸馏水或去离子水，或相同纯度的水。

4.1 硫酸溶液［c(H2SO4 戸3mol/L］量取750mL水于2L的烧杯中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸(p20=1.84g/mL)冷却 到室温后转移至2L容量瓶中，用水定容4.2缓冲溶液(pH=6.8)包括下列组分：a) 26.0g 一水柠檬酸(C6H807.H20)；6 8 7 2b) 14.0g 氢氧化钠；c) 78.0g 无水乙酸钠［Na(CH3CO2)］用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL正丙醇，用水定容 该溶液于4C暗处可稳定保存几周4.3氯胺T溶液称取1.41g三水・N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T）,用lOOmL缓冲溶液（4.2）溶解临用时配制4.4 显色剂称取lO.Og对二甲胺基苯甲醛，用35mL高氯酸溶液［60%（质量分数）］溶解，缓慢加入65mL 异丙醇临用前配制若对二甲胺基苯甲醛需纯化（见 8.4 注），可按如下操作：用 70%（体积分数）热乙醇配 制对二甲胺基苯甲醛饱和溶液依次在室温和冰箱中冷却， 12h 后，用布氏漏斗过滤用少量 70%（体积分数）乙醇洗涤布氏漏斗中的固体将固体转移至三角瓶中，用 70%（体积分数） 热乙醇重新溶解固体，加入冷水充分搅拌，至有大量乳白色晶体析出，于冰箱中过夜。

用布 氏漏斗过滤固体，用 50%（体积分数）乙醇洗涤后，在有五氧化二磷干燥剂的条件下进行真 空干燥4.5 L-羟脯氨酸标准溶液4.5.1 标准储备液称取50mg L-羟脯氨酸于lOOmL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（4.1），用水定 容该溶液于4°C下可稳定存放1个月4.5.2 标准工作液移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容分别吸取该溶液10.00mL、 2O.OOmL、3O.OOmL、4O.OOmL 于 1OOmL 容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度依次为 0.5yg/ mL、l.Oyg/ mL、1.5yg/ mL、2.0yg/ mL临用前配制5 仪器和设备及材料实验室常规仪器及下列仪器、材料5.1 分析天平：感量 O.OOO1g5.2三角瓶：容量为100 mL,长颈，小口5.3表面皿：直径为5cm〜6cm5.4 干燥箱：可控温于 105C±1C5.5 圆形滤纸：直径为 12.5cm5.6 容量瓶： 250 mL、 100 mL5.7 比色管： 25 mL5.8 铝箔或不透明塑料薄膜5.9 水浴锅：可控温于 60C±1C5.10分光光度计：可用波长558nm±2 nm；或使用光电比色计，其中干涉滤波器最大吸收波长 为 558nm±2 nm。

5.11 比色皿：光程为 1cm6 分析步骤6.1 试样制备贮藏在冰箱中液体食品，在实验前取出并达室温6.1.1 液态试样准确称取试样10g，精确至0.0001g，置于100 mL三角瓶中（5.2），避免试样粘在三角瓶 壁上6.1.2 固态试样准确称取均匀试样2〜5g，精确至O.OOOlg,置于100 mL三角瓶中（5.2）,避免试样粘在 三角瓶壁上若加入硫酸溶液（4.1）后糊底，不能摇匀，如乳粉等试样，可准确称取均匀试 样15g，精确至O.OOOlg，置于烧杯中，加入水搅拌均匀，并定容于100mL容量瓶中准确吸 取10mL于100 mL三角瓶中，避免试样粘在三角瓶壁上6.2 水解6.2.1量取30mL±1 mL硫酸溶液（4.1），加入三角瓶中，用表面皿盖住，于105°C干燥箱内 恒温 16h6.2.2用圆形滤纸趁热将水解产物过滤至250mL容量瓶中，用10mL硫酸溶液（4.1）分三次 洗涤烧瓶和滤纸，再用水洗涤，用水定容，摇匀注意开始过滤时滤纸和漏斗干燥无水滴）6.2.3用移液管移取10mL水解产物（6.2.2）至100mL容量瓶中，定容6.3 标准曲线的绘制6.3.1移取4.00mL不同浓度的标准工作溶液（4.5.2）于比色管中，加入2.00mL氯胺T溶液 （4.3），混合后于室温下放置 20min±1min。

6.3.2加入2.00mL显色剂（4.4）于比色管中，充分混合，用铝箔或塑料薄膜（5.8）将比色 管封口6.3.3将比色管迅速放入60C水浴中，加热20 min6.3.4 取出比色管，用流动水迅速冷却比色管，室温下放置 30 min6.3.5用水做参比，于558 nm±2 nm处用分光光度计或光电比色计测定吸收值6.3.6 以扣除了空白的标准工作液的吸光度为纵坐标，以相应的浓度为横坐标，绘制标准曲 线6.4 空白测试移取4.00mL水于比色管中，按6.3.1至6.3.5操作若空白溶液的吸收值超过0.040，则 需重新配制显色剂，如有必要，需纯化二甲胺基苯甲醛（ 4.4）6.5 试样的测定移取 4.00mL 水解稀释溶液（6.2.3）于比色管中，按 6.3.1 至 6.3.5 操作扣除空白溶液 的吸收值（6.4）,从（6.3）标准曲线查得水解产物中L-羟脯氨酸的浓度7 计算液态试样中的L-羟脯氨酸含量按下列公式计算：V1V3CX10-6 250X100XCX10 -6 0.25CX= X100 = X100= V2m 10Xm m式中：X 试样中L-羟脯氨酸的含量，％；V]——水解产物定容体积，mL；V2——移取定容后水解产物体积，mL；V3——水解产物二次定容体积，mL；C—由标准曲线得到的试样溶液中L-羟脯氨酸的浓度，单位为微克每毫升（聘/ mL）； m 参与水解反应的试样质量，单位为克（g）;计算结果保留至小数点后三位。

8 允许差同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的 5%。