具核梭杆菌对牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌致病作用的影响

具核梭杆菌对牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌致病作用的影背景和目的牙周炎是多种细菌混合感染所致的口腔炎症性病变，可以导致牙 周支持组织的破坏和牙齿的松动脱落以往的研究表明，牙周组织的细菌性感染 是由口腔菌群和其周围的上皮细胞相互作用的结果因此，研究不同种类的牙周致病菌及其宿主细胞之间的互动影响是非常必要 的到目前为止，在龈下菌斑生物膜中发现至少有300多种不同种类的细菌龈下细菌的聚集有一定规律，按照它们的聚集特点以及与牙周状况的关系， 分为6个主要的微生物复合体与牙周炎关系紧密的牙龈口卜啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis,Pg)和伴放线聚集杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)分别为红色复合体和绿色复合体然而，他们经常在橙色复合体存在的环境中被发现，比如有具核梭杆菌 (Fusobacterium nucleatum,Fn)的微生态系Fn是一种有致病潜力的口腔共生 菌，其独特之处是能够与几乎所有的口腔细菌发生共聚，可以作为共聚桥连接早 期定植的细菌和晚期定植的细菌因其具有广泛的共聚能力被认为在牙菌斑成熟过程中发挥重要作用,在牙周 病变的进展过程中起到了间接的促进作用。

此外，有研究表明Fn能够与Pg和Aa 相互影响与其他感染性疾病相似，致病菌对上皮细胞表面的粘附和随即发生的入侵过 程是牙周炎发病的关键阶段数十年以来，致病菌的入侵能力一直被认为是牙周 炎的潜在致病因子由于不同菌种之间的相互作用,Pg、Aa与Fn的相互共聚、同时感染可能会 影响它们对牙龈上皮细胞的粘附和入侵细菌与其周围上皮细胞间的相互作用是 细菌感染过程中的重要阶段，牙龈上皮细胞既是物理性屏障，同时还传递细菌信 号，是检测细菌存在的传感器，维持健康和疾病之间的平衡在先天性免疫防御机制中，细菌与上皮细胞之间的相互作用可以刺激上皮细 胞表达多种免疫反应介质其中，白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)是一种强 有效的致炎因子,能够促进中性粒细胞的趋化、激活中性粒细胞并且诱导其增殖而6 -防御素族的人6 -防御素2(human P -defensin 2,hBD-2)不仅可以吸 引单核细胞、促进中性粒细胞的趋化，也能够激活先天性和获得性免疫防御在 先天性免疫应答中，橙色复合体中的细菌和红色复合体中的细菌所产生的功效是 不同的，分别归属于两种不同复合体的细菌间的相互影响可能会调节IL-8和 hBD-2的表达，从而在牙龈组织的免疫调节方面产生协同效应。

因此，本研究的目的在于观察Fn与主要的牙周致病菌Pg、Aa的相互共聚、 同时感染对Pg、Aa粘附和入侵牙龈上皮细胞能力的影响，以及对牙龈上皮细胞 IL-8的生成和hBD-2表达的影响Pg、Aa单独粘附和入侵牙龈上皮细胞，以及 Pg、Aa与Fn相互共聚、同时感染时粘附和入侵牙龈上皮细胞的能力均被检测此外,Pg、Aa单独或与Fn相互共聚、同时感染牙龈上皮细胞时，利用酶联免 疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A)和实时荧光定量 PCR(real-time PCR, RT-PCR)分别测定牙龈上皮细胞IL-8和hBD-2的表达方 法1、Pg、Aa单独或与Fn相互共聚、同时感染时粘附和入侵Ca9-22细胞能力的 研究牙龈上皮细胞接种于12孔平底细胞培养板，细胞密度为2.0X105 /孔,每孔 lml在致感染之前，细胞用磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate-buffered saline, PBS, pH7.4)洗两遍，用无抗生素的最小必需培养基(minimal essential medium, MEM)培养2小时三种不同的菌种接种于脑心浸液肉汤(Sigma, USA) 上,补充0.5% 的酵母提取物，氯化血红素(5^ g/ml)和维生素K1(5p g/ml),细菌培养2天直到 OD660nm 达到 1-0。

经PBS洗过之后,菌细胞悬浮于MEM细菌悬液(2.0X 107/孔)加入铺满的单 层Ca9-22细胞中，在37°C、5%CO2的孵育箱内培养在粘附部分的检测中，细菌与单层Ca9-22细胞孵育1小时，然后单层细胞用 PBS洗四遍，去除未粘附的细菌接下来每孔加入1ml的无菌蒸馏水用于裂解细 胞达90分钟，将溶解产物稀释1000倍,接种于脑心浸液血琼脂平板(Brain Heart Infusion agar-Supplemented,BHI-S),每板 100p 1 菌液，在 37C厌氧环境中培 养10天在入侵部分的检测中，细菌与单层Ca9-22细胞孵育4小时在接下来的孵育 过程中，单层细胞用PBS洗四遍，去除未粘附的细菌，接种于含200p g/ml甲硝唑 和300p g/ml的庆大霉素的MEM中培养1小时，杀灭粘附于细胞外面的细菌暴露于抗生素之后，单层细胞经PBS洗两遍，用每孔1ml的无菌蒸馏水裂解细 胞90分钟将溶解产物稀释100倍,接种于BHI-S血琼脂平板，每板100p l菌液， 在37C厌氧环境中培养10天粘附和入侵的微生物所形成的菌落形成单位按照接下来的孵育状况进行计 算，细菌粘附和入侵的能力用细胞溶菌作用后重新获得的细菌相对于起初加入的 细菌总量的百分率表示。

2、Pg、Aa单独或与Fn相互共聚、同时感染Ca9-22细 胞时IL-8和hBD-2表达的研究为了检测Ca9-22细胞所分泌的IL-8的总量，细菌 悬液(2.0X 107/孔)加入铺满Ca9-22的单层细胞中37C、5%CO2孵育4小时然后收集细胞培养液上清,-20°C保存ELISA定量分析细胞培养液上清中IL-8的浓度，用鼠IL-8单克隆抗体(1:100, Dako)作为捕获抗体包被微孔板重组IL-8或在测试样品中捕获的鼠抗体通过加入的兔IL-8多克隆抗体进行 检测，随即加入生物素化的羊抗兔IgG (1:200, Dako)和链霉亲和素-辣根过氧化 物酶(horseradish peroxidase, HRP)以及 HRP 底物 2,2’ -联氮基双37C孵育 45分钟，测试样品中IL-8的浓度通过已知浓度的重组B溶血性链球菌 (beta-hemolytic streptococcal, BHS)和 IL-8 所生成的标准曲线测得从Ca9-22细胞提取的总RNA(2微克)进行逆转录，使用(dT)18和 Superscript H酶(Invitrogen),反应混合物25微升，42C反应1小时。

在20微 升体系中进行实时PCR,反应混合物含有1微升模板cDNA、SYBR Premix Ex Taq、 ROX Reference Dye (Sigma, USA)和每一种引物(0.2 微摩尔)使用的引物序列是：GAPDH正向引物,5’ -CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3'和反 向引物 5’ -CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3’ ; hBD-2 正向引物 5’ -AGACTCAGCTCCTGGTCAAGCTC-3 ’ 和反向引物 5’ -TGGCTCCACTCTTAAGGCAGGTA-3’ 为了防止扩增出污染的基因组DNA,所有的引物被设计可以扩增至少两个外显子扩增在荧光热循环仪(StepOne Plus)中按照以下条件进行：94C预变性1 分钟,然后是95C变性15秒、62C退火15秒和72C延伸33秒,共40个循环 通过熔解曲线分析和3%琼脂糖凝胶检验来验证PCR产物的特异性在目的基因扩增的同时也扩增管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),使用 2-ACT 计算相比 GAPDH的相对拷贝数。

结果1、Pg, Aa单独或与Fn相互共聚、同时感染时粘附 和入侵Ca9-22细胞能力的研究Pg、Aa和Fn单独粘附细胞的能力分别是0.97 +0.38%,2.62±0.58% 和 1.06±0.30%Pg与Fn相互共聚、同时感染时,Pg粘附Ca9-22的能力被明显增强至两倍 (P<0.05)Aa粘附Ca9-22细胞的能力在Fn存在的状态下比A2处理组约升 高 178.24%(P<0.05)这些结果显示与Fn共同孵育后的Pg、Aa粘附Ca9-22细胞的能力被增强， 然而这样的效果可以被Fn的粘附、入侵抑制剂半乳糖所抑制Pg、Aa和Fn单 独入侵细胞的能力分别是0.35±0.08%,1.01±0.15%和0.44±0.11%Pg、Aa入侵Ca9-22细胞的能力在Fn存在的状态下比缺乏Fn时分别显著增 强251.43%和207.92%(P<0.05)这些结果表明Fn能够有效增强Pg、Aa入侵 Ca9-22细胞的能力，然而这样的效果可以被半乳糖所抑制2、Pg、Aa单独或与Fn相互共聚、同时感染Ca9-22细胞时IL-8和hBD-2 表达的研究在单种细菌感染的实验中,A3处理组中Ca9-22细胞的IL-8产生量最 高(428.75 pg/ml)，相反的，IL-8产生量最低的为A1处理组(386.66 pg/ml)。

在 多种细菌感染的实验中，与A3处理组相比,B1和B2处理组中IL-8的产生量分别 降低 6.12%和 8.05%而在C1-C4处理组中，IL-8的产生量均比B1-B4处理组轻度升高 (P<0.05)在单种细菌感染的实验中，A3处理组中Ca9-22细胞hBD-2 mRNA 的表达最高(0.48),相反的,hBD-2 mRNA表达最低的为A1处理组(0.26)在多种细菌感染的实验中，与A3处理组相比,B1和B2处理组中hBD-2 mRNA 的表达分别降低66.94%和51.39%与此同时，在C1-C4处理组中，hBD-2 mRNA的 表达均相应的比B1-B4处理组有所升高(P<0.05)结论1、与Fn共聚后,Pg和Aa粘附、入侵牙龈上皮细胞的能力被增强，增强 效果可以被半乳糖所抑制2、与Fn共聚后的Pg和Aa下调牙龈上皮细胞IL-8 的生成和hBD-2的表达，下调程度可以被半乳糖所抑制。