豌豆和玉米远缘杂交后代的SRAP分析

豌豆和玉米远缘杂交后代的SRAP分析朱培坤;李朝阳;李菁;李鹏【摘要】采用相关序列扩增多态性(SRAP)技术分析了豌豆和玉米远缘杂交后代的 真实性.结果表明,10对SRAP引物中，共扩增出105条重复性高的清晰条带，其中有 101条为多态.多态比率(PPB)为96.19%;聚类结果显示，后代与母本间呈现出并列关 系,表明其基因组确实发生了改变;em1-me2、em3-me1和em8-me4三对引物 在杂交后代中都扩增出双亲特异带,说明这2个杂交后代具有双亲的遗传物质，该后 代是豌豆和玉米成功远缘杂交的真实杂种后代.【期刊名称】《湖南农业科学》 【年(卷)，期】2010(000)021 【总页数】3页(P13-15) 【关键词】豌豆;玉米;远缘杂交;SRAP 【作者】朱培坤;李朝阳;李菁;李鹏【作者单位】深圳市百绿生物染色体杂交研究所广东深圳518172洁首大学植物 资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首416000;吉首大学植物资源保护 与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首416000;吉首大学植物资源保护与利用湖 南省高校重点实验室，湖南吉首416000【正文语种】中文 【中图分类】Q321.3野生近缘杂交是优良农艺性状获得的重要途径之一，通过种间杂交及后代选育，可 得品质优良的作物新品种。

远缘杂交是属以上的种间杂交，容易存在杂交不亲和及 后代不育等现象，给新品种育种带来困难近期在植物属间远缘杂交方面取得了很 大的进展，目前已在多个属间如小麦属与黑麦属［1］、偃麦草属［2］、草莓属［3］，动 物如鸡与鹤鹑等［4］的属间远缘杂交取得了成功远缘杂交的成功给农作物杂种生 产，改良农作物品质带来了曙光豌豆属蝶形花科豌豆属植物，玉米属禾本科玉米属植物，二者分属双子叶植物纲和 单子叶植物纲近期有学者尝试将豌豆与玉米进行了远缘杂交，并获得了可育的后 代［5］研究其杂种后代的遗传基础，对评价其杂种后代真实性以及进一步研究利 用有重要意义相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）是 一种新的DNA分子标记，具有简便、稳定、中等产率和容易得到选择条带序列等 特点，广泛应用于图谱构建、性状的标记、遗传多样性分析以及杂交后代真实性的 鉴定［6］本实验对豌豆和玉米杂交后代进行SRAP分析，检测其杂交后代的真实 性，以期为该杂交后代的合理开发利用提供理论参考1材料与方法1.1材料供体豌豆（Py）、受体玉米（MF、M540）、杂交后代（Py-MF和Py-M540） 种子都由深圳百绿生物科技有限公司提供［5］。

试验于2008年4月将5个供试种 进行播种，生长期记录生长状况，7月采集各植株叶片进行相关试验1.2方法1.2.1 DNA提取取5个类型植株的叶片混合，改良CTAB法提总DNA1.2.2 PCR扩增及检测从42对SRAP引物中筛选出10对引物进行扩增（引物序 列见表1 ）扩增程序为：94°C预变性5 min;94°C变性1 min ,35°C复性1 min,72°C延伸 1 min , 5 个循环；94°C变性 1 min ,50°C复性 1 min ,72°C延伸1 min , 35个循环；最后72^延伸10 min用1%的琼脂糖电泳检测扩增产物， 电泳结束后在英国UVP公司的GDS 7500凝胶成像系统中成像，拍摄并保存结果 表1试验所用SRAP引物编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0上游引物me1:5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'me1:5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'me1:5'- TGAGTCCAAACCGGATA-3'me1:5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'me1:5'- TGAGTCCAAACCGGATA-3'me2:5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3'me2:5'- TGAGTCCAAACCGGAGC-3'me4:5'-TGAGTCCAAACCGGACC-3'me4:5'-TGAGTCCAAACCGGACC-3'me5:5'-TGAGTCCAAACCGGAAG-3 '下游引物 em1:5'-GACTGCGTACGAATTAAT-3'em2:5'-GACTGCGTACGAATTTGC- 3'em3:5'-GACTGCGTACGAATTGAC-3'em4:5'-GACTGCGTACGAATTTGA- 3'em9:5'-GACTGCGTACGAATTCGA-3'em1:5'-GACTGCGTACGAATTAAT- 3'em2:5'-GACTGCGTACGAATTTGC-3'em8:5'-GACTGCGTACGAATTCTG- 3'em6:5'-GACTGCGTACGAATTGCA-3'em1:5'-GACTGCGTACGAATTAAT- 3f1.2.3数据统计和分析将电泳得到的扩增图谱的每一条带都代表引物的结合位点。

有扩增条带记为1,无带记为0，强带和弱带的赋值都为1对于多态位点，将在 重复试验中能稳定出现的差异带用于数据分析利用GenePOP软件对RAPD分 析所得到的表型矩阵进行遗传参数分析仅计算Nei's遗传距离（D），并根据 Nei's遗传距离，利用GenePOP软件的UPGMA法分析居群间的遗传关系2结果与分析2.1玉米生长期形态差异观察如图1所示，从幼苗开始，Py-M540的茎尖严重右向卷曲，导致茎尖横向生长， 故植株矮小且节间短，茎秆瘦弱，株高仅为受体M540的一半，但成熟叶片与受 体M540的叶形无差别，M540的茎尖也有轻微卷曲，但仍然向上生长而同一 供体的另一杂交后代Py-MF则表现出与Py-M540完全不同的形态特征：长势强 壮，叶片短而宽大，叶片基部夹角非常小，几乎与茎秆平行的成簇上伸，并不卷曲， 节间非常短，其受体MF的茎尖也不卷曲，叶片长而宽，节间长图1受体玉米及其杂交后代的生长期形态特征（a：Py-M540；b：M540；c： Py-MF ；d ：MF）2.2 10对弓物对豌豆和玉米及其杂交后代的扩增结果对42对SRAP引物进行筛选扩增，最终选择了扩增条带清晰，多态性强的10对 引物对Py、MF、M540、Py-MF和Py-M540进行了扩增，共获得105条重复 性高的清晰条带，其中有101条为多态，多态比率（PPB）为96.19%。

2.3供体和受体基因在2个杂交后代中的表达10 对引物中，me1-em9、me1-em3、me1-em4、me2-em1 和 me4-em8 5对引物在Py-M540和Py-MF中扩增出双亲特异带（图2）在Py-MF和Py- M540中出现了 Py的特征带（图中箭头所指），表明2个后代具有双亲的遗传物 质，豌豆的遗传物质进入了玉米基因组，此结果从DNA分子水平上初步证实了 Py-M540和Py-MF可能是豌豆和玉米杂交的真实后代图2豌豆和玉米杂交后代的SRAP验证（从左到右：MF, Py-MF , Py , Py-M540 , M540 ; a : me2-em1扩增结果；b : me1-em3扩增结果；箭头指示亲 本特征带）2.4 SRAP标记的聚类分析根据SRAP引物扩增结果，对5个样本进行了遗传距离计算和聚类分析（表2,图 3）观察等位基因数na = 1.961 9，有效等位基因数ne=1.629 3 , Nei基因多样 性指数h为0.370 3从遗传距离比较来看，Py-MF与Py-M540的距离最近，与 其亲本MF的距离次之，与供体Py的距离最远同样，Py-M540与其亲本 M540的关系次于它与Py-MF的关系距离。

以Nei的遗传距离为基础作聚类图， 大致可分为3个聚类群，其中供体PY单独列为一群，2个受体M540和MF列为 一群，供体与2个受体的后代PY-M540和PY-MF单独列为一群这说明杂种后 代的DNA序列发生了改变，导致后代与亲代间的从属关系变成了并列关系从扩 增结果中后代有？尸基因的表达，表明这种改变极有可能来自豌豆基因的插入表2遗传距离注：1——PY、2——M540、3——MF、4——PY-M540、5—— PY-MFpop ID 12345****12345****1.475 9 0.965 1 1.286 7 1.098 6****0.363 5 0.405 5 0.405 5****0.495 1 0.297 3****0.259 5 图3遗传距离聚类图 3结论与讨论在异源多倍化早期染色体片断变化是一个比较普遍现象，这可能有利于实现新合成 物种快速进化［7］在染色体分裂的某一特定时期，外源染色质的加入导致受体细 胞不能识别，夕卜源染色质顺利参与了受体细胞的有丝分裂和减数分裂，从而出现具 有外源核小体与受体核小体两种核小体形成的螺线体和超螺线体［5］而这种导入 极有可能是因为DNA序列在不同染色体组之间迅速变化所造成，这种DNA序列 的变化在具有AABB染色体组的四倍体小麦中注入节节麦的DD染色体组形成异 源六倍体小麦的早期阶段被证实。

本试验利用SRAP引物扩增分析表明2个杂交 后代的DNA序列也发生了改变，亲本之一的玉米表达出来的条带在2个杂种后代 中基本都有表达，较少消失此外，2个后代还产生了大量的新带，多数更与豌豆 相似，后代产生的条带多样性远远高于各自的亲本，也说明了后代的DNA序列确 实发生了改变近年来，作为一种新型分子标记，SRAP在物种遗传多样性及远缘杂交特别是属间 杂交的后代鉴定中得到广泛应用薛丹丹等［8］利用SRAP标记对结缕草属杂种后 代的鉴定研究表明，杂交后代的基因重组导致扩增条带丰富的变异，表现为条带的 增加或缺失，且后代中有父本特征带的，鉴定为真实杂种后代高丽霞等在用 SRAP标记分析姜花属间杂交育种时发现，亲缘关系太近或太远(均值0.4 ~0.6), 都会在后代中受自交不亲和性影响，而降低结实率，由此说明遗传距离的远近或许 是属间远缘杂交成功的一个重要影响因子本试验所用材料是不同纲间的种类杂交， 但结果表明，2个杂种后代除了保持各自受体玉米的特征带且较少消失外，还产生 了大量新带，其中一些条带与供体豌豆的特征带一致，可以证明2个杂交后代 DNA序列的改变来自于豌豆基因的插入，是豌豆和玉米的真实杂交后代。

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