农杆菌介导薰衣草转化体系的建立与冷诱导基因的导入

农杆菌介导薰衣草转化体系的建立与冷诱导基因的导入薰衣草是唇形花科薰衣草属多年生半阴性亚灌木植物,原产于地中海地区， 是主要的天然香料植物之一由于薰衣草在我国境内难以安全越冬，其种植区域 及商业利用都受到了约束运用基因工程技术，通过有针对性的转基因改良方法，可以在提高薰衣草耐 寒能力的同时，改善薰衣草精油的质量和产量本研究在优化薰衣草再生系统和 农杆菌介导遗传转化体系的基础上，采用农杆菌介导法获得了含雪莲冷诱导基因 (XCH)的转基因薰衣草，以期提高薰衣草抗寒能力和精油产量，同时为利用转基 因技术改良薰衣草耐寒能力和品质提供参考依据主要研究结果如下：1.通过试验确定了薰衣草(Lavandula angustifolia,cv.Munstead)不同外植体离体培养的最佳培养基，并对多种影响 因素进行了研究结果表明，薰衣草茎段直接再生的最佳培养基为:MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0 mg/L薰衣草愈伤组织高频再生体系为:愈伤诱导继代培养基MS+2,4-D 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L,芽分化培养基 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L将不同 外植体来源的薰衣草再生芽丛中较粗壮的的单芽切下后接种在芽继代培养基 MS+NAA 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L 上，壮苗 30d 左右，转入生根培养基 1/2MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L后可获得薰衣草的组培再生苗。

2.通过对抑菌剂Cef、筛选剂Hyg浓度、农杆菌EHA105生长曲线及影响转 化率的因素的研究，初步建立了根癌农杆菌介导的薰衣草叶片来源的愈伤组织和 茎段的遗传转化体系愈伤组织的遗传转化最适条件为:在MS+2.4-D0.1 mg/L+6-BA0.5 mg/L培养基上继代2周，大小为2〜3mm²的愈伤组织, 经OD₆₀₀0.5左右的农杆菌侵染10min,共培养2 d,延迟筛选10 d;Cef的脱菌浓度为200 mg/L,Hyg的筛选浓度为10 mg/L,筛选抗性愈伤4周，30 mg/L Hyg继续筛选抗性愈伤，10 mg/L Hyg芽分化生长筛选浓度,5 mg/L Hyg生 根抗性筛选浓度茎段遗传转化最适条件为:在MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 2.0mg/L培养基上，预 培养3d,经OD₆₀₀0.5左右的农杆菌侵染15 min,共培养3 d,延迟筛 选7 d;以200 mg/L Cef为脱菌浓度，10 mg/L Hyg为茎段分化抗性筛选浓度,5 mg/L Hyg生根抗性筛选浓度两种转化系统所获得的GFP瞬时表达率都很高，均在90% 以上。

愈伤组织筛选3周后,抗性愈伤率为37.7%茎段在筛选培养基上筛选3周 后，抗性率为15.6%但最后仅愈伤组织再生系统获得了 1棵转基因苗3.对通过愈伤组织再生系 统获得的转基因植株进行PCR扩增，得到了与阳性对照XCH（643bp）目的基因相 同的特异片断，从分子水平上证明了目的基因已经整合到薰衣草基因组中，转化 率达到1.03%。