饲料中三聚氰胺的测定

饲料中三聚氰胺的测定Determination of Melamine in Feeds前言本标准参考美国食品药品管理局（FDA）实验室方法和国内相关实验室的方法，提出了饲料中三聚氰胺的测定方法本标准的附录A为资料性附录本标准由农业部畜牧业司提出本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口本标准起草单位：国家饲料质量监督检测中心（北京）本标准起草人：赵根龙、王培龙、宋荣、索德成、马东霞、张苏、李丽蓓，杨曙明、苏晓鸥正文1 范围本标准规定了测定饲料中三聚氰胺的含量的高效液相色谱法（HOLC）和气相色谱质谱联用法（GC-MS），其中GC-MS法为确证法本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、植物性蛋白饲料、宠物饲料（干粮，罐头）中三聚氰胺的测定本标准中HPLC法最低定量限为2.0mg/kg，GC-MS法最低定量限为0.05mg/kg2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改但（不包括勘误的内容）或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可适用这些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 22195 动物饲料 式样的制备 3 HPLC法3.1 原理试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定3.2 试剂与材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂和符合GB/T 6682的三级水，色谱用水符合GB/T 6682一级水的规定3.2.1甲醇：色谱纯3.2.2乙腈：色谱纯3.2.3氨水：浓度25%~28%3.2.4混合型阳离子交换固相萃取柱：60mg,3ml3.2.5三氯乙酸溶液 10/L:称取10g三氯乙酸加水至1000ml3.2.6氨水甲醇溶液：量取5ml氨水，溶解于100ml甲醇中3.2.7乙酸铅溶液22g/L：取22g乙酸铅用约300ml水溶解后定容至1L3.2.8滤膜：0.45μm，有机相3.2.9甲醇溶液：200ml甲醇（3.2.1）加入800ml一级水，混匀3.2.10流动相：称取2.02g庚烷磺酸钠和2.10g柠檬酸于1L容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度取该溶液900ml加入100ml乙腈（3.2.2）3.2.11三聚氰胺标准品（纯度＞99%）。

3.2.12三聚氰胺标准溶液3.2.12.1标准储备液：称取100mg（精确到0.1mg）的三聚氰胺标准品，用甲醇溶液（3.2.9）溶解并定容于100ml容量瓶中，该溶液浓度为1mg/ml，于4℃冰箱贮存，有效期三个月3.2.12.2标准中间液：吸取标准储备液5.00ml,于50ml容量瓶内，用甲醇溶液（3.2.9）定容至50ml，该溶液三聚氰胺溶液浓度为100μg/ml，于4℃冰箱贮存，有效期一个月3.2.12.3标准工作液：用移液管分别一曲标准中间液1ml、5ml、10ml、25ml、50ml于5个100ml容量瓶内，用甲醇溶液（3.2.9）定容，该溶液三聚氰胺浓度为1.0μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml于4℃冰箱贮存，有效期一周3.3仪器与设备3.3.1高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器或紫外检测器3.3.2离心机：10000r/min3.3.3涡旋混合器.3.3.4超声破清洗器3.3.5氮吹仪，可控温至60℃.3.3.6固相萃取装置3.3.7高速匀质器3.3.8索式提取器3.3.9震荡摇床3.4试样制备按照GB/T 20195的规定制备试样。

3.5测定步骤3.5.1提取3.5.1.1配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、植物性蛋白饲料和宠物饲料（干粮）中三聚氰胺的提取称取5g试样（精确至0.01），准确加入50ml三氯乙酸溶液（3.2.5），加入2ml乙酸铅溶液（3.2.7）摇匀，超声提取20min静止2min，去上层提取液约30ml转入离心管，在10000r/min离心机上离心5min3.5.1.2宠物饲料（罐头）中三聚氰胺的提取称取5g试样（精确至0.01），加入50ml乙醚，摇床上120r/min振荡1H，弃去乙醚，再加入50ml乙醚，摇床上120r/min振荡1h，弃去乙醚，其余步骤同3.5.1.13.5.2净化分别用3ml甲醇，3ml水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确移取10ml离心液分次上柱，控制过柱速度在1ml/min以内再用3ml水和3ml甲醛洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽近干后用氨水甲醛溶液（3.2.6）3ml洗脱洗脱液50℃氮气吹干，准确加入甲醇溶液（3.2.9），涡旋振荡1min，过0.45μm滤膜，上级测定3.5.3滤相色谱条件色谱柱：C8柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒度5μm；或性能相当的色谱柱。

柱温：室温流动相流速：1.0ml/min检测波长：240nm3.5.4测定按照保留事件进行定性，试样与标准品保留时间的相对偏差不大于2%，单点或多点校正外标法法定量待测样液中三聚氰胺的响应值应在工作曲线范围内3.6结果计算和表术3.6.1试样中三聚氰胺的含量X，以质量分数毫克没千克（mg/kg）表示，单点校正按式（1）计算：3.6.2结果表示平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字3.7重复性在同一个实验室由同仪操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于10%4 GC-MS法4.1方法原理试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，用N,O-双三甲基•硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，以气相色谱质谱联用仪进行定性和定量4.2试剂和材料4.2.1衍生化试剂：BSTFA+1%三甲基氯硅烷（TMCS）4.2.2吡啶：优级纯4.2.3其他试剂和材料同3.2.1~3.2.8、3.2.11、3.2.12.4.2.4标准工作液：用移液管分别吸取标准工作液（3.2.12.3）中浓度为10μg/ml的溶液0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml于5个100ml容量瓶内，用甲醇定容，该溶液三聚氰胺浓度为0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml。

4.3仪器和设备4.3.1气相色谱质谱联用仪4.3.2衍生化取4.4.1的稀释液适量用氮气吹干，加入200μL的吡啶和200μL的衍生化试剂（4.2.1），混匀，70℃反应30min同时，用三聚氰胺标准系列（4.2.4）或相应浓度单点标准做同步衍生4.4.3测定4.4.3.1 GC-MS条件色谱仪：柱长30m，内径0.25mm，甲基苯基聚硅氧烷涂层，膜厚0.25μm载气：氮气，流速为1.3ml/min进样量：1μL进样口温度：250℃升温程序：起始温度75℃，持续1.0min，以30℃/min升温至300℃，保持2.0min传输线温度：280℃.运行时间：10.5min扫描范围：60m/z～400m/z扫描模式：选择离子扫描监测离子99m/z、171m/z、327m/z离子源温度：230℃EI源轰击能：70eV4.4.3.2 侧定定性方法：试样与标准品保留事件的相对偏差不大于0.5%，特征离子丰度与标准品相不大于20%定量方法：以342、327、171和99峰面积之和进行单点或多点校正定量4.5结果计算和表述4.5.1试样中三聚氰胺的含量X，以质量分数毫克每千克（mg/kg）表示，单点校正按式（3）计算：多点校准时，可用公式（4）：4.5.2平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

4.6重复性在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于20%附录A（资料性附录）三聚氰胺标准图谱A.1三聚氰胺标准色谱图见图A.1A.2三聚氰胺标准紫外光谱图见图A.2A.3三聚氰胺标准品衍生物选择离子色谱图见图A.3A.4三聚氰胺衍生物选择离子质谱图见图A.4。