HBsAg免疫对小鼠TB细胞功能的影响

实实验验流流程程1W1.双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验 2.酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)OVA+CFA加强免疫加强免疫小鼠小鼠500 l 摘眼球取血摘眼球取血无菌取脾和胸腺无菌取脾和胸腺分离血清分离血清2W取脾和胸腺取脾和胸腺淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 生理盐水加强免疫小生理盐水加强免疫小鼠鼠500 l 2WAfter 1W对照组对照组实验组实验组抗体效价抗体效价增殖功能增殖功能免疫血清分离过程免疫血清分离过程摘眼球取血RT for 2hrsRotation3000rpm for 20minTransfer serum to a new EPDouble diffusionStore at 4ELISA1.5ml EP1.1.小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒2.2.于超净台内取出脾和胸腺组织于超净台内取出脾和胸腺组织(各各1/2)1/2)，分别放入预先盛有，分别放入预先盛有2 2ml ml IMDMIMDM培养液的平皿内培养液的平皿内3.3.将将3-43-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。

然后用压组织，将其捣碎然后用10001000l l加样器隔着纱布将细胞悬液吸加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入出，放入1.51.5ml EPml EP管中1.1.取上述制备好的细胞悬液混匀后取出取上述制备好的细胞悬液混匀后取出2020l l，加到盛有加到盛有980980l l计数液计数液的的EPEP管中，在显微镜下计数，计数方法见后管中，在显微镜下计数，计数方法见后2.2.调细胞浓度至调细胞浓度至1 110107 7/mlml，所需量为所需量为1.51.5mlml，设需要的细胞悬液体积设需要的细胞悬液体积为为AmlAml,可按公式：可按公式：?/?/mlmlA=1.5A=1.51 110107 74v细胞培养：细胞培养：1.按图所示加板按图所示加板2.2.将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37 5%C037 5%C02 2培养箱中，培养箱中，培养培养4848小时vMTT掺入：掺入：（隔一天（隔一天 下午下午2:00）1.1.在终止培养前在终止培养前2 2小时，在显微镜下观察细胞转化情况小时，在显微镜下观察细胞转化情况2.2.每孔内加入每孔内加入MTTMTT（5mg/ml)105mg/ml)10l l，加完后轻轻搕板，使，加完后轻轻搕板，使MTTMTT和细胞混匀。

和细胞混匀3.3.在在37 5%C037 5%C02 2培养箱中继续培养培养箱中继续培养2 2小时，然后离心小时，然后离心2000rpm2000rpm，5min5min，轻轻弃，轻轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）4.4.加入加入100100l l 二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO)DMSO)，将颗粒溶解，将颗粒溶解隔一天（隔一天 下午下午4:004:00）v结果测定：结果测定：1.1.结果测量：用酶标仪测定光密度值：结果测量：用酶标仪测定光密度值：A570nmA570nm（用空白孔调零），记录结（用空白孔调零），记录结果2.2.结果判定：结果判定：SISI（刺激指数）（刺激指数）=Con A=Con A刺激孔刺激孔 A A值值/对照孔对照孔A A值值v八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺v每孔加入每孔加入100 l调好的细胞悬液调好的细胞悬液v1-3孔加入孔加入10%FCS-IMDM 培养液，培养液，100 lv4-6孔加入孔加入2.5 g/ml的的Con A,100 lv7-9孔加入孔加入5 g/ml的的Con A,100 lv10-12孔加入孔加入10 g/ml的的Con A,100 l NOTE:ConA用用10%FCS-IMDM培养液配制培养液配制1-34-67-910-12spleen cell+10%IMDMspleen cell+ConA 2.5g/mlspleen cell+ConA 5g/mlspleen Cell+ConA 10g/ml spleen cell+10%IMDMspleen cell+ConA 2.5g/mlspleen cell+ConA 5g/mlspleen Cell+ConA 10g/mlthymus cell+10%IMDMthymus cell+ConA 2.5g/mlthymus cell+ConA 5g/mlthymus Cell+ConA 10g/ml thymus cell+10%IMDMthymus cell+ConA 2.5g/mlthymus cell+ConA 5g/mlthymus Cell+ConA 10g/mlN.S.OVAN.S.OVA 返回返回v八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺v每孔加入每孔加入100 l调好的细胞悬液调好的细胞悬液v1-3孔加入孔加入10%FCS-IMDM 培养液，培养液，100 lv4-6孔加入孔加入2.5 g/ml的的Con A,100 lv7-9孔加入孔加入5 g/ml的的Con A,100 lv10-12孔加入孔加入10 g/ml的的Con A,100 l 1-34-67-910-12spleen cell+10%IMDMspleen cell+ConA 2.5g/mlspleen cell+ConA 5g/mlspleen Cell+ConA 10g/ml spleen cell+10%IMDMspleen cell+ConA 2.5g/mlspleen cell+ConA 5g/mlspleen Cell+ConA 10g/mlthymus cell+10%IMDMthymus cell+ConA 2.5g/mlthymus cell+ConA 5g/mlthymus Cell+ConA 10g/ml thymus cell+10%IMDMthymus cell+ConA 2.5g/mlthymus cell+ConA 5g/mlthymus Cell+ConA 10g/mlN.S.OVAN.S.OVA。