SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选霉变烟叶特异性标志蛋白

目录摘要 2前言 2l 材料与措施 41.1 样品采集 41.2仪器与试剂 41.3 试剂的配制 41.3.1电泳缓冲液的配制 41.3.2样品缓冲液制备 41.3.3考马斯亮蓝R-250固定液的配制 41.3.4考马斯亮蓝R-250染液的配制 41.3.5考马斯亮蓝脱色液的配备 41.4烟叶蛋白的提取 41.5聚丙烯酰胺凝胶电泳 41.6考马斯亮蓝染色 52 成果与讨论 53 展望 6道谢 7参照文献 7SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选霉变烟叶特异性标志蛋白摘要：为了找出霉变烟叶里的特异性标记，我们采集了75个霉变烟叶样品，以及11个正常烟叶样品作为对照运用聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以检测和分析出不同的蛋白带型正常烟叶的特异性标志蛋白已经被鉴定出来（相对分子质量大概为20Da）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选霉变烟叶里的特异性标志蛋白，找出了霉变烟叶和正常烟叶里的蛋白质指纹差别，为建立迅速、精确的烟叶霉变检测措施提供了先决条件核心词：霉变烟叶；蛋白指纹；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳Screen for Specific Biomarker in Molded Flue-Cured Tobacco Leaves by SDS - Polyacrylamide Gel ElectrophoresisAbstract: To screen relatively specifically markers in molded flue-cured tobacco leaves (FCTL), 75 samples of molded FCTL were collected and an additional 11 samples of unmolded FCTL were used as controls. The protein profiles were detected and analyzed by SDS - polyacrylamide gel electrophoresis. A FCTL-specific biomarker (relative molecular weight is 20Da) was identified. The pattern of the marker provides a powerful and reliable diagnostic method for molded FCTL with high sensitivity and specificity.Key words: Molded flue-cured tobacco leaves; Fingerprints; SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis前言烟草是以收获叶片为主的重要经济作物，烟叶的自然醇化或人工发酵是提高烟叶燃吸品质和可用性的重要环节之一。

烟叶自然醇化贮藏周期长，由于烟叶吸湿性强，而烟叶中又具有微生物生长所需要的多种营养物质，一旦条件合适，烟叶在贮藏过程中极易滋生多种微生物而发生霉变中国烟草仓储面积达700万m2在烟叶仓储损耗中，烟叶霉变导致的损失十分严重，影响烟叶的外观品质和香味品质，减少烟叶的使用价值，特别南方烟区烟叶霉变甚至成为影响公司经济效益的重要因素［1］除了经济上的需要外，尚有另一种重要因素，那就是：烟叶的微生物污染应被控制在至少量［4］众所周知，许多真菌毒素对人体有毒性，如黄曲霉素，是目前发现最强的化学致癌物质，同步具有致畸和致突变作用，而此类真菌又往往是诱发烟叶霉变的生物因子微生物分解运用烟叶中蛋白质时，先分泌蛋白酶到细胞外，将蛋白质水解成为短肽后再透入细胞，细胞内的肽酶进而将肽水解成氨基酸在霉变烟叶中，会浮现烟叶的蛋白质氮减少，而非蛋白质氮增长的现象，在一般状况下，霉变烟叶的总氮不会减少，有时反而会增长 ，这重要是由于微生物大量繁殖所形成的物质转化的成果［2］氨基酸除可直接用于微生物自身新蛋白质的合成外，不同的微生物在相应的酶系催化下，也可通过脱氨基作用和脱羧基作用进一步分解，生成诸多代谢产物，影响烟叶的品质。

如氨、硫化氢、吲哚和类臭素等物质可使霉变的烟叶腐败发臭；由于产生的有机酸的积累，可使烟叶酸度增高；微生物分解氨基酸的另某些产物，如硫醇类等黄色物质，能使烟叶发褐变色，增进褐变反映 ，使烟叶失去原有色泽；二元氨基酸经脱羧后，能生成二元胺，如腐胺、尸胺、精胺以及色胺、酪胺和组胺等，不仅使烟叶发出恶臭，还会使烟叶及其制品带毒，严重影响食用卫生［4］在烟叶储藏中，可以根据烟叶霉变的生物化学和微生物学原理，判断烟叶的稳定性，评价烟叶品质，及时设计对策，控制烟叶环境，克制微生物在粮食上的代谢活动，有效地保护烟叶安全随着吸烟与健康问题越来越受到人们的注重，避免烟叶霉变将成为卷烟生产上必须解决的重要课题[2]通过研究，导致烟叶霉变的因素有诸多，有内因，也有外因概括起来重要有如下几点：①病原微生物的影响 ①烟叶具有合适微生生长物的营养物质 ②温度与湿度的影响 ③烟叶成熟度和包装材料的影响［14］微生物在烟叶及其制品上活动危害时，并不能直接吸取烟叶中的多种复杂的营养物质，必须依托其分泌的胞外酶，在细胞外将烟叶中大分子物质(淀粉、纤维素、蛋白质和脂肪等)水解为可溶性的低分子物质 ，才干吸取到细胞内加以运用，这是微生物进行营养的基本特点［4］。

因此，烟叶霉变过程，就是微生物分解和运用烟叶中有机物质的生物化学过程，实质上就是微生物以烟叶为营养基质 ，进行消化、吸取和运用的营养过程 ，这个过程涉及了微生物进行物质代谢和能量代谢的生物化学反映［3］微生物的物质代谢，涉及分解代谢和合成代谢两个方面前者是微生物将烟叶中复杂的有机物质，先在细胞外分解为低分子化合物，然后吸取，再在细胞内氧化分解 ，获得营养、转化和释放能量的过程；后者则是微生物运用储存能量，以低分子的中间代谢物质为原料，合成新的细胞物质的过程因此，微生物在烟叶上的代谢活动，保证了微生物自身的生长、发育和大量繁殖，其成果反映在烟叶上，便是霉变的发生和发展由此可见，烟叶霉变的生物学基本是微生物与环境所进行的物质互换和能量转化［10］生物功能的重要体现者是蛋白质，复杂的基因间和蛋白质的互相作用，细胞内的活动和黄静影响都会影响基因的体现及蛋白质的翻译后加工［8］蛋白质作为一种空间和时间上动态的整体，各个蛋白质之间的互相作用，机密而有序地连接在一起，形成多种子系统，实现特定的生理功能［5］从基因水平到蛋白质水平的深化，已成为生命科学研究的迫切需要和新的任务运用电泳技术检测植物蛋白质的异质性 ,并以此作为分类、进化和遗传研究的根据 ,早已得到广泛的应用［7，15］。

蛋白质作为基因的直接稳定产物 ,能反映生物构成上的差别因此我们想到通过筛选霉变烟叶异性标志蛋白，可觉得建立烟叶霉变检测措施奠定基本[9]本文运用聚丙烯酰胺凝胶电泳法来筛选霉变烟叶异性标志蛋白l 材料与措施1.1 样品采集 仓储霉变烟叶75个和正常烟叶11个由昆明卷烟厂提供1.2仪器与试剂 DYY-10型电泳仪，SIGMA13高速离心机，奥豪斯2140电子天平，脱色摇床，琼脂糖，40%丙烯酰胺，甘油， Tris-Cl，SDS，过硫酸铵，TEMED，正丁醇，溴芬兰，考马斯亮蓝R-250，冰醋酸，甲醇，亚甲双丙烯酰胺，蒸馏水. 1.3 试剂的配制1.3.1电泳缓冲液的配制：Tris碱3g，甘氨酸14.4g，SDS1g，加蒸馏水至1L，pH8.3，冰箱里备用.1.3.2样品缓冲液制备：1mol/L Tris-HCl 0.6ml，加入50%甘油5ml，10%SDS2ml，2巯基-乙醇0.5ml，1%溴芬兰1ml，蒸馏水0.9ml，4℃冰箱中寄存备用.1.3.3考马斯亮蓝R-250固定液的配制：取400ml乙醇、100ml冰醋酸、500ml水.1.3.4考马斯亮蓝R-250染液的配制：取0.04g考马斯亮蓝R-250，甲醇18ml，蒸馏水18ml，冰醋酸4ml.1.3.5考马斯亮蓝脱色液的配备： 取400ml甲醇、100ml冰醋酸、500ml水.1.4烟叶蛋白的提取 将混合后的正常烟叶和霉变烟用液氮充足研磨，各称取 50 mg ，加入200ul样品缓冲液后置于 Eppendoff 管中，沸水浴中保温 10min,10000 r/min 离心 10 min，所得上清即是样品蛋白，- 20 ℃冰箱贮存备用。

1.5聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.5.1将电泳槽玻璃板洗净烘干，然后放于胶条凹槽中，后固定到电泳槽夹板中，将低的玻璃板面向黑色负极，按对角线上紧螺丝将通电泳缓冲液的孔用乳胶塞塞上，取冷却未凝的0.8%琼脂糖液70ml倒于玻板和电泳槽的两个电缓槽中，接近负极的的一侧加40ml左右，室温冷凝，保证将玻板封严而不漏胶1.5.2取40%丙烯酰胺 5.00ml，pH8.8的4XTris'cl/SDS5.00ml, H2O 10.0ml，10%过硫酸铵70µl，TEMED15µl浓度的分离胶1.5.3用注射器将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边沿加入玻璃板夹层中，至离低玻板3cm处用另一注射器顺着玻璃顶部缓慢加入正丁醇2cm高室温聚合30~60min1.5.4倾去正丁醇，并以1XTris'cl/SDS,pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面用滤纸吸干表面水分1.4.5按顺序配积层胶（4%浓度）：混匀0.65ml30%丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙烯酰胺溶液，1.25mlpH6.8的4Xtris-Cl/SDS缓冲液和3.05ml水，真空下脱气10~15min，加入25 µl10%过硫酸铵和5µl TEMED,摇匀，立虽然用，注射器加到离顶部5mm处将厚度与夹层厚度一致的梳子插入其中，补充剩余空隙，室温凝30~45min。

1.5.5在1.5ml离心管中解决蛋白质，解决MarK措施：100℃沸水5分钟，冰浴5分钟，13000rpm离心两分钟其她蛋白解决措施：100℃沸水20分钟，其她同上1.5.6待胶凝后，向电泳槽中倒1XSDS电泳缓冲液，一边没过低玻璃斑上沿，一边没过泳槽一半的金属丝，浸泡几分钟后小心拔出梳子，用注射器吹洗胶孔几次，通低电压几分钟后断电1.5.7、用枪加入样品蛋白5µl，恒压电泳，积层胶用85V，当溴芬兰批示剂过了分离胶界面时电压调为150V耗时3~4.5h1.5.8将冷凝管接好通水保持胶的稳定，当溴芬兰至胶低0.5cm处关电源，撤导线和水管，弃去电泳缓冲液，将电泳夹层取出标记凝胶，用刀片将凝胶与玻璃边沿处划一两次，保护胶的脱离1.6考马斯亮蓝染色1.6.1凝胶的固定液中轻微摇荡1小时1.6.2凝胶在染色液中摇荡过夜.1.6.3胶在脱色液中摇荡过夜消除背景.1.6.3用洗脱液洗脱至背景无色后,用扫描仪采集电泳图.2 成果与讨论微生物在烟叶及其制品上活动危害时，并不能直接吸取烟叶中的多种复杂的营养物质，必须依托其分泌的胞外酶，在细胞外将烟叶中大分子物质(淀粉、纤维素、蛋白质和脂肪等)水解为可溶性的低分子物质 ，才干吸取到细胞内加以运用，这是微生物进行营养的基本特点。

一般状况下的霉变烟叶中，会浮现烟叶的蛋白质氮减少，而非蛋白质氮增长的现象本实验中霉变烟叶里浮现的特异性蛋白，很也许是大量繁殖的微生物的自身蛋白微生物在烟叶上的代谢活动，保证了微生物 自身的生长、发育和大量繁殖，其成果反映在烟叶上，便是霉变的发生和发展图1 聚丙烯酰胺凝胶电泳成果120(kda)8647342620 ①②③正常烟叶 ④⑤⑥⑦霉变烟叶由图1可知,霉变烟叶中浮现了蛋白分子量约为20kda的蛋白条带，而在正常烟叶中则没有浮现这样的特异蛋白因此我们可以通过进一步筛选霉变烟叶异性标志蛋白，检测引起烟叶霉变的微生物类群此外,霉变和正常这两种不同样品间的蛋白除一段差别蛋白点外,在87kda~120kda附近有相似蛋白系列，为烟叶自身的蛋白组系列通过总蛋白一维电泳指纹图谱分析完全可以辨别霉变和正常烟叶，对于差别性蛋白点和相匹配蛋白点可以给出明确的鉴定3 展望蛋白质氨基酸鉴定上的应用已经应用于中医药界药物的检查,疾病的迅速检查，食物过敏原的迅速检测、分析和鉴定等等,成果证明以聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质指纹图谱鉴定不同实验样品的总蛋白的确可行,并且检测分析成果在不同实验仪器和耗材之间具有良好的重现性和稳定性,这对建立迅速、精确的烟叶霉变检测措施提供了良好的基本。

我们有理由相信，运用筛选霉变烟叶特异性标志蛋白，很有可可以找到迅速、精确的烟叶霉变检测措施接下来，我们要探讨更进一步地分离纯化蛋白质，用更精确的蛋白质分离技术分离霉变烟叶中的蛋白质，对比微生物的蛋白图谱，从而找出霉变烟叶中微生物中的类型道谢在毕业论文过程当中，我得到了诸多教师和同窗的关怀和协助在此论文完毕之际，我要向她们表达我最真诚的谢意一方面我要感谢我的指引教师李文鹏教师感谢李教师让我承当这个研究课题，并在实验中给与我悉心的指引和支持，教给我科研的措施，在实验过后悉心指引毕业论文的写作正是在李教师的协助下我才干顺利完毕毕业论文我要感谢周海军、王建雄、李金龙和徐晓川同窗，她们在实验中给我很大的协助和启发感谢同宿舍同窗在我实验不顺利时给我的支持和鼓励论文的完毕和她们也是分不开的，在此我向她们一并表达最衷心的感谢！参照文献:[1] 黄福新,周兴华,朱桂宁,晏卫红,等.广西烟仓霉变发生状况调查及重要霉变因素[J]. ，4：411~414[2]连宾,烟叶霉变及防治[J]. 贵州科学．1998，6：124~127.[3]周建新,论粮食霉变中的生物化学，南京经济学院食品科学与工程系.：19~11.[4]李梅云,高家合,王革,微生物对烟叶蛋白质含量的影响[J].生物技术通报，.增刊：376~380[5]吴海强,余晓,刘志刚,食品过敏原指纹图谱迅速检测研究[J].热带医学杂志，,02：131~134[6]吴莉莉,林爱英,郑宝周,电子鼻检测技术在粮食霉变辨认中的应用研究[J].安徽农业科学，,37(21)：10133~10135[7]高德民,5个生姜品种的蛋白电泳指纹图谱研究[J].中国野生植物资源, , 28（4）：51~ 53[8] 柳俊刚, 高枫, 张森, 刘传渊，采用蛋白指纹图谱技术筛选大肠癌特异性有关蛋白[J]. 中国一般外科杂志.,4： 350 ~355[9]李梅云，祝明亮，王革，等．防烟叶霉变菌株对烟叶霉变的影响[J]．生命科学研究，.8(3)：278~282．[10] 许大风,杨建卿,檀根甲.储烟病害研究及其进展[J],安徽农业科学,，10:134~136.[11] Ronald E. Welty, Larry A Nelson. Growth of Aspergillus repens in Flue-Cured Tobacco [J]. Applied Microbiology, 1971, 25 (1):854~859.[12] Vincent W. O gundero. Studies on thermophilic fungi associated with the spoilage of flue-cured tobacco leaves during storage [J]. Mycopathologia, 1983, 82(3): 153~158.[13] 晏卫红, 黄思良, 朱桂宁, 等. 广西仓储烟叶霉变微生物的分类鉴定[J]. 烟草科技, , 2: 50~56.[14]王革,张中义,孔华忠,等.云南烟叶贮藏期霉变研究(1)-曲霉[J].云南农业大学学报, , 17(4): 356~359.[15]李明,梁成沛穿心莲种子蛋白质电泳鉴定的初步研究[J]. 广东药学院学报, ，5： 470~472.。