基因工程3-3基因操作的工具酶

3.3 DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶：能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的游离3-OH末端，使核苷酸发生聚合作用，而不从模板上解离反应特点：(1)以四种三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）为底物(2)反应需要模板的指导，加入的核苷酸由模板链所决定(3)聚合反应需要有引物存在，且引物要有3-OH游离基团(4)DNA链的生长方向为5 3(5)产物DNA链的性质与模板相同（半保留复制）DNA聚合酶只能在已有的核酸链上延伸DNA链，而不能从无到有开始DNA链的合成种类：到目前为止，已从E.coli 中发现了Pol I、Pol II、Pol III三种DNA聚合酶其中Pol I 和Pol II的主要功能是参与DNA的修复过程，Pol III与DNA的复制有关三种聚合酶中，只有Pol I 同分子克隆关系密切3.3.1 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I（E.coli DNA Pol I）DNA Pol I是从大肠杆菌细胞中分离得到的，该酶是由单一多肽组成的球蛋白，MW=109000，直径=65 DNA Pol I已得到高度纯化，从100 kg大肠杆菌中可以分离到约500 mg纯化的酶蛋白。

每个成熟的大肠杆菌细胞中约有400个分子的Pol I1.DNA Pol I在空间结构上有三个位点：在空间结构上有三个位点：(1)DNA模板结合位点结合模板 (2)核苷酸-磷酸结合位点结合引物 (3)dNTP结合位点结合底物2.DNA Pol I是一种多功能酶：是一种多功能酶：(1)5 3的聚合酶活性 催化单核苷酸逐个地结合到DNA模板的3-OH末端，沿着引物的3-OH方向按模板顺序从5 3延伸每分子DNA pol I每分钟可以催化约1000个核苷酸的聚合2)5 3的外切酶活性 只作用于双链DNA（dsDNA），从5端切割下一个个单核苷酸3)3 5的外切酶活性 能从游离的3末端降解单链DNA（ssDNA）成为单核苷酸，通常对双链DNA不作用在正常聚合条件下，该酶对dsDNA的3 5外切酶活性受到5 3聚合酶活性的抑制但一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，由3 5外切酶迅速除去错误进入的核苷酸，然后聚合反应才得以继续进行下去所以3 5核酸外切酶活力被认为起着校对功能，对DNA复制的忠实性极为重要3.E.coli DNA Pol I在基因工程中的用途在基因工程中的用途:(1)可用于填补dsDNA上的缺口，以便有效地进行DNA重组 (2)用于DNA序列分析 (3)用于制备DNA探针 在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。

当外切酶活性从缺口的5一侧移去一个5核苷酸后，聚合作用就会在缺口的3一侧补上一个新的核苷酸随着反应的进行，5一侧的核苷酸不断地被移去，3一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合 成 的 方 向 移 动 缺 口 平 移（N i c k Translation）应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的反应体系是：在25 l总体积中含有1 g纯化的特定的DNA片段，并加入适量的DNase I、pol I、32PdNTP和未标记的dNTP脱氧核糖核苷酸酶 I（DNase I）是一种内切酶，它能够水解单链或双链DNA，形成带有5-磷酸末端的单（寡）核苷酸由于32PdNTP比较昂贵，所以一般都采用低浓度的32PdNTP（2 mol/L）和高浓度的未标记的dNTP（20 mol/L）而且就大多数实验的要求，使用一种32PdNTP就足够了，其他3种均可采用未标记的dNTP，或是用适量的未标记的dNTP稀释每种32PdNTP改变反应体系中DNase I的数量，可以控制32PdNTP的参入程度，一般希望有30%左右的32PdNTP参入DNA链3.3.2 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I的的Klenow片段片段 （E.coli DNA Pol I Klenow fragment）用蛋白酶将DNA Pol I 作有限水解，可得到分子量为75000 dal和36000 dal的两个片段，大片段即称为Klenow片段，它具有5 3的聚合酶活性和3 5的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5 3的核酸外切酶活性。

Klenow聚合酶可以标记DNA片段末端（5延伸末端）对于限制性核酸内切酶EcoR I切割后形成的5延伸末端可用32PdATP标记：而BamH I切割后形成的5延伸末端可用32PdGTP标记：3.3.3 T4 DNA聚合酶聚合酶 是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一种特殊的DNA聚合酶1.T4 DNA聚合酶也是一种多功能酶：聚合酶也是一种多功能酶：(1)5 3的聚合酶活性(2)3 5的外切酶活性 其外切酶活性比E.coli DNA Pol I 的活性高200倍3)取代反应活性 如果在反应混合物中仅存在一种dNTP，则此酶的3 5外切酶活性将从dsDNA的3末端降解，直到互补于这个dNTP的碱基出现为止，然后在这一位置发生取代反应2.T4 DNA聚合酶在基因工程中的应用聚合酶在基因工程中的应用(1)以填充反应标记带有5延伸末端的dsDNA片段(2)将DNA的3延伸末端切成平末端(3)以取代反应标记带有3延伸末端或平末端的dsDNA片段(4)以部分消化dsDNA法标记DNA片段作为杂交探针（链特异的探针）3.3.4 逆转录酶逆转录酶 是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶，其产物DNA称cDNA，即互补DNA。

1.1.逆转录酶也是一个多功能酶：逆转录酶也是一个多功能酶：(1)RNA依赖的DNA聚合酶 以RNA链为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿5 3方向合成DNA链几乎所有真核生物的mRNA分子3末端都有一段Poly A，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板，由此可合成cDNA2)DNA依赖的DNA聚合酶 以ssDNA为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿5 3方向合成DNA链可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA3)外切RNA酶活性 底物是RNA-DNA杂交分子中的RNA链，其水解方向有两种：*从RNA链 5末端外切：称5 3外切RNA酶 *从RNA链 3末端外切：称3 5外切RNA酶2.逆转录酶在基因工程中的应用：逆转录酶在基因工程中的应用：主要用途是转录真核生物的mRNA成为cDNA，从而制备基因片段3.商品化的逆转录酶有两种：商品化的逆转录酶有两种：(1)禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶(2)Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆转录酶 AMV逆转录酶虽能更有效地拷贝复杂的mRNA，但它有很强的外切RNA酶活性而Mo-MLV逆转录酶的外切RNA酶活性较弱，更有利于制备全长的cDNA。

两种逆转录酶均无3 5外切DNA酶活性，故不具备校对功能，在高浓度dNTP和Mn2+存在下，容易出现核苷酸错误掺入3.4 DNA和和RNA的修饰酶的修饰酶3.4.1 核酸酶核酸酶SI1.作用特点：作用特点：此酶是从米曲霉（Aspergillus oryzae）中提取的，可降解ssDNA或ssRNA，又称单链特异性酶，其降解产物是5-磷酸末端的单或寡核苷酸片段核酸酶SI对DNA底物的活性比对RNA强高浓度的核酸酶SI可从缺口（nick）或小裂缝（gap）处降解dsDNA2.作用条件：作用条件：需要Zn2+作为辅助因子，最适pH是4.5，这是与基因工程的其它工具酶不同的两个特点3.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴，因而在质粒的重建和DNA重组中被广泛使用1)切除单链粘性末端，产生平末端，再用T4连接酶连接2)切除cDNA的发夹结构3.4.2 末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶1.作用特点：作用特点：此酶是从小牛胸腺中提取的，可催化单核苷酸转移到另一个DNA分子的3-OH末端上，不需要模板，其引物是带3-OH末端的ssDNA（Mg2+为辅因子）。

平末端的dsDNA只有CO2+存在时才能作引物2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：在连接平末端DNA片段时加上互补的同源多聚物（同聚物加尾法）3.4.3 外核酸酶外核酸酶III1.作用特点：作用特点：此酶是从E.coli中分离得到的，是一种从dsDNA的3-OH末端降解产生5单核苷酸的外切酶2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：(1)产生具有5延伸末端的DNA片段(2)制备特异的DNA探针3.4.4 外核酸酶外核酸酶Bal 311.作用特点：作用特点：此酶是从乳白短杆菌（Brevibacerium aldidum）中提取的能以渐进的方式从线型DNA分子的3，5两端同时降解，产物是单核苷酸或寡核苷酸片段底物可以是带延伸末端或是平末端的dsDNA，对3、5两端的降解速度相同2.作用条件：作用条件：降解时需要Ca2+作辅助因子，以EDTA作螯合剂，可使Bal 31失活3.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：可用于组建DNA的物理图谱，以及造成克隆DNA分子的末端缺失3.4.5 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1.作用特点：作用特点：此酶是从噬菌体T4感染的E.coli中分离的能催化ATP的-磷酸转移到DNA或RNA的5-OH末端上。

2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：可用于缺乏5-磷酸的待连接DNA片段的5端磷酸化：反转录mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR扩增得到的DNA都缺少5-磷酸基，在与克隆载体连接之前，需用T4多核苷酸激酶将DNA的5-磷酸化3.4.6 碱性磷酸化酶（碱性磷酸酯酶）碱性磷酸化酶（碱性磷酸酯酶）1.作用特点：作用特点：从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAP，从小牛肠中分离的简称CAP它能特异性地切去DNA或RNA的5-磷酸底物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，也可以是核糖或脱氧核糖核苷三磷酸2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：(1)在用32P标记DNA的5末端之前，除去磷酸2)在DNA重组技术中，除去DNA片段的5-磷酸，阻止质粒自身环化，提高转化效率形成带有两个缺口的开环分子，由于环状DNA（即使是有缺口的环状DNA）的转化效率比线状质粒DNA片段高得多，因此绝大多数转化子都含有重组质粒，并且这样的缺口在寄主细胞内可自行补上9、静夜四无邻，荒居旧业贫22.10.822.10.8Saturday,October 08,202210、雨中黄叶树，灯下白头人21:27:4821:27:4821:2710/8/2022 9:27:48 PM11、以我独沈久，愧君相见频。

22.10.821:27:4821:27Oct-228-Oct-2212、故人江海别，几度隔山川21:27:4821:27:4821:27Saturday,October 08,202213、乍见翻疑梦，相悲各问年22.10.822.10.821:27:4821:27:48October 8,202214、他乡生白发，旧国见青山2022年10月8日星期六下午9时27分48秒21:27:4822.10.815、比不了得就不比，得不到的就不要2022年10月下午9时27分22.10.821:27October 8,202216、行动出成果，工作出财富2022年10月8日星期六21时27分48秒21:27:488 October 202217、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前下午9时27分48秒下午9时27分21:27:4822.10.89、没有失败，只有暂时停止成功！22.10.822.10.8Saturday,October 08,202210、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有21:27:4821:27:4821:2710/8/2022 9:27:48 PM11、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。

22.10.821:27:4821:27Oct-228-Oct-2212、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美21:27:4821:27:4821:27Saturday,October 08,202213、不知香积寺，数里入云峰22.10.822.10.821:27:4821:27:48October 8,202214、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏2022年10月8日星期六下午9时27分48秒21:27:4822.10.815、楚塞三湘接，荆门九派通2022年10月下午9时27分22.10.821:27October 8,202216、少年十五二十时，步行夺得胡马骑2022年10月8日星期六21时27分48秒21:27:488 October 202217、空山新雨后，天气晚来秋下午9时27分48秒下午9时27分21:27:4822.10.89、杨柳散和风，青山澹吾虑22.10.822.10.8Saturday,October 08,202210、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话21:27:4821:27:4821:2710/8/2022 9:27:48 PM11、越是没有本领的就越加自命不凡。

22.10.821:27:4821:27Oct-228-Oct-2212、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿21:27:4821:27:4821:27Saturday,October 08,202213、知人者智，自知者明胜人者有力，自胜者强22.10.822.10.821:27:4821:27:48October 8,202214、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏2022年10月8日星期六下午9时27分48秒21:27:4822.10.815、最具挑战性的挑战莫过于提升自我2022年10月下午9时27分22.10.821:27October 8,202216、业余生活要有意义，不要越轨2022年10月8日星期六21时27分48秒21:27:488 October 202217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息下午9时27分48秒下午9时27分21:27:4822.10.8MOMODA POWERPOINTLorem ipsum dolor sit amet,consectetur adipiscing elit.Fusce id urna blandit,eleifend nulla ac,fringilla purus.Nulla iaculis tempor felis ut cursus.感 谢 您 的 下 载 观 看感 谢 您 的 下 载 观 看专家告诉。