流式抗体及荧光染料的选择PPT学习教案

会计学1流式抗体流式抗体(kngt)及荧光染料的选择及荧光染料的选择第一页，共21页2 抗原抗体反应抗原抗体反应12流式抗体的选择、荧光染料流式抗体的选择、荧光染料(rnlio)(rnlio)应用应用第1页/共21页第二页，共21页3第2页/共21页第三页，共21页4抗原表位与抗体抗原表位与抗体(kngt)高变区间的互补结合高变区间的互补结合抗原表位与抗体抗原表位与抗体(kngt)高变区的沟槽分子表高变区的沟槽分子表面的结合面的结合 抗原抗体之间的结合力抗原抗体之间的结合力亲水胶体转化为疏水胶亲水胶体转化为疏水胶体体物物质质基基础础第3页/共21页第四页，共21页5特异性特异性可逆性可逆性比例比例(bl)(bl)性性阶段性阶段性第4页/共21页第五页，共21页6特异性：抗原与抗体特异性：抗原与抗体结合结合(jih)(jih)反应的反应的专一性专一性抗原抗体抗原抗体(kngt)(kngt)反应特异反应特异性示意图性示意图分子基础分子基础(jch):(jch):抗原表位与抗体抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性分子高变区之间空间构型的互补性第5页/共21页第六页，共21页7可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件一定条件(tiojin)(tiojin)下又可解离为游离抗原与下又可解离为游离抗原与抗体的特性抗体的特性 影响因素：影响因素： 抗体对相应抗体对相应(xingyng)(xingyng)抗原的亲合力亲合力越抗原的亲合力亲合力越高，结合越牢固，越不易解离高，结合越牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响环境因素对复合物的影响pHpH、离子强度、离子强度 第6页/共21页第七页，共21页。

8前带前带(prezone)(prezone)：抗体过量：抗体过量后带后带(postzone)(postzone)：抗原过量：抗原过量等价带等价带(equivalence zone)(equivalence zone)： 抗原抗体比例抗原抗体比例(bl)(bl)合适合适 抗原抗原(kngyun)(kngyun)抗体反应比例性示抗体反应比例性示意图意图比例性：抗原与抗体发比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定生可见反应需遵循一定(ydng)(ydng)的量比关系的量比关系第7页/共21页第八页，共21页9阶段性阶段性第一阶段：特异性结合第一阶段：特异性结合(jih)(jih)阶段，反应快，阶段，反应快，不可见不可见 第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、 沉淀和细胞溶解等现象沉淀和细胞溶解等现象第8页/共21页第九页，共21页10一、反应物自身因素一、反应物自身因素抗原抗原(kngyun):(kngyun):理化性状、表位种类和数理化性状、表位种类和数目目抗体抗体: :来源、特异性、亲和性、效价来源、特异性、亲和性、效价二、环境因素二、环境因素电解质电解质: : 生理盐水生理盐水(shnglynshu)(shnglynshu)或缓冲或缓冲液液酸碱度酸碱度: pH6: pH6pH9pH9（pH7.2pH7.2pH7.4pH7.4）温温 度度: 15: 154040（4 4 ），），3737最适最适第9页/共21页第十页，共21页。

11流式抗体流式抗体(kngt)(kngt)的选择、荧光染料应用的选择、荧光染料应用第10页/共21页第十一页，共21页12RUOASRIVD类体外诊断类体外诊断(zhndun)(zhndun)试剂试剂分析分析(fnx)(fnx)物特异性试剂物特异性试剂仅用于研究仅用于研究(ynji)(ynji)第11页/共21页第十二页，共21页13v单克隆抗体单克隆抗体(kngt)(kngt)v混合单克隆抗体混合单克隆抗体(kngt)(kngt)v多克隆抗体多克隆抗体(kngt)(kngt)荧光直标的抗体荧光直标的抗体未标记的抗体（需要荧光标记的二抗进行间接未标记的抗体（需要荧光标记的二抗进行间接(jin ji)(jin ji)标记检测）标记检测）单分子荧光单分子荧光(ynggung)(ynggung)素素复合分子荧光复合分子荧光(ynggung)(ynggung)素素第12页/共21页第十三页，共21页14信噪比（信噪比（S/NS/N）：特异性荧光）：特异性荧光(ynggung)(ynggung)信号（信号（signalsignal）与非特异）与非特异性荧光性荧光(ynggung)(ynggung)信号的比值信号的比值PEAPCPE-Cy5PerCP-Cy5.5FITCPerCPPEAPCPE-Cy5PerCP-Cy5.5FITCPerCPS/NS/N越大，表越大，表明阳性与对明阳性与对照细胞的荧照细胞的荧光光(ynggung(ynggung) )峰分离越好峰分离越好，当，当S/NS/N大于大于3 3时属于可接时属于可接受范围受范围第13页/共21页第十四页，共21页。

15综合因素：综合因素：荧光标记效率：抗体上标记荧光素的数量（荧光标记效率：抗体上标记荧光素的数量（E/PE/P比值）比值）也会影响相对也会影响相对(xingdu)(xingdu)荧光强度荧光强度 抗体检测的抗原密度：高密度的抗原几乎可以用任何抗体检测的抗原密度：高密度的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高较高S/NS/N比值的荧光素（如比值的荧光素（如PEPE和和APCAPC）标记的抗体检测）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和何阴性细胞群的目，从而达到有效区分阳性细胞群和何阴性细胞群的目的细胞自发荧光：检测自发荧光水平高的细胞时，使用细胞自发荧光：检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如发射光波长较长的荧光染料（如APCAPC）可以得到较好的）可以得到较好的S/NS/N比值第14页/共21页第十五页，共21页16易与被标记的抗原、抗体(kngt)或其他生物物质结合而不影响被标记物得特异性稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂和固定剂的影响第15页/共21页第十六页，共21页17第16页/共21页第十七页，共21页。

18第17页/共21页第十八页，共21页19v根据仪器选用荧光素：根据仪器选用荧光素：1.1.每个通道每个通道(tngdo)(tngdo)只能选择只能选择1 1种荧光素种荧光素v 2. 2.各个通道各个通道(tngdo)(tngdo)之间的荧光素可以随意之间的荧光素可以随意搭配搭配v搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小第18页/共21页第十九页，共21页20注意：注意：1.1.不要为了节省荧光抗体，未经过预实验就按抗体说明书减半不要为了节省荧光抗体，未经过预实验就按抗体说明书减半量甚至更多进行标记量甚至更多进行标记2.2.不能完全凭感觉进行标记，需进行细胞计数不能完全凭感觉进行标记，需进行细胞计数3.3.应用应用FITCFITC标记抗体时，避免使用酸性缓冲溶液，因为标记抗体时，避免使用酸性缓冲溶液，因为FITCFITC的的荧光特性是荧光特性是pHpH依赖的4.4.荧光抗体、荧光染色的样本应避免暴露荧光抗体、荧光染色的样本应避免暴露(bol)(bol)于强光下于强光下5.5.建议尽快上机检测（最好建议尽快上机检测（最好24h24h内）第19页/共21页第二十页，共21页。

21陈晓东陈晓东 产品技术产品技术(jsh)专员专员第20页/共21页第二十一页，共21页。