噬菌体分离与纯化

大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体 2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：   （1）  培养寄主细胞（大肠杆菌）；   （2）  采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；   （3）  将样品内的细胞进行富集培养；   （4）  制备噬菌体裂解液；   （5）  检测噬菌体是否存在；   （6）  噬菌体的纯化及效价测定3.培养基的配制（配方）与灭菌 （1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：     牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4. （2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.   （3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。

 （4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4      封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】    1.菌种：大肠埃希氏菌    2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水    3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基    4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱 ，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋实验方法步骤】  第一周：实验方案的讨论与完善  第二周：培养基的配制及相关实验器材的灭菌        牛肉膏蛋白胨固体培养基100ml，并取三个试管各加入3—4ml以搁斜面保留菌种        3X牛肉膏蛋白胨培养液50ml，装小三角瓶内        牛肉膏蛋白胨培养液100ml分装到5个大试管中，每管9ml，并依次标记10-5—10-1，剩余的装试管  做好标记        离心管12个（包好）        无菌水2管（3—4ml每管）        玻璃涂布器3个（包好）     将以上物品包好、做好标记，于121℃灭菌20min，对3个牛肉膏蛋白胨固体培养基搁斜面。

第三周：      周日下午      1.    接菌种：将大肠杆菌接种于搁号的斜面上（保留菌种）      2.    大肠杆菌的活化：挑取一环大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，（试管中）      3.    将大肠杆菌和敏感菌悬液于37℃恒温培养18h,备用      周一中午      4.    取上述敏感菌培养液6ml至盛有50ml 3×牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，于37℃恒温培养6h      5.    将大肠杆菌菌种和剩余敏感菌培养液置于4℃冰箱保存备用      周一晚上      6.    加污水100ml至敏感菌培养液和3×牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，于37℃恒温培养      周二晚上      7.    制备裂解液：将以上增殖的混合培养液用2500r/min 离心30min,取上清液      8.    将上清液再次用2500r/min 离心15min,取上清液4℃保存备用      9.    融化固体培养基、倒平板3个，先在平板表面滴加培养至对数期的大肠埃希氏菌菌液数滴，用无菌涂布棒涂匀带菌被平板培养基吸干后，在其上滴加上述上清液5-7滴于含菌平板表面，同时在同一平板的某区域上滴加无菌水对照。

     10.将平板倒置于37℃恒温培养     11.配置牛肉膏蛋白胨半固体培养基50ml，并按3.5ml每管分装到5个试管中，做好标记于121摄氏度灭菌20min     周三下午：     12.观察平板，验证污水中是否有噬菌体（实验现象、结果见后面分析）第四周：     周二晚上：     1、噬菌体样品的稀释：将已证明有噬菌体的上清液用牛肉膏蛋白胨培养液依次稀释为10-1，10-2，10-2，10-4，10-5  5个稀释度     2、倒 底层平板：取无菌 培养皿5只，每个培养皿倒入约10ml牛肉膏蛋白胨琼脂培养基作底层，依次标明10-1，10-2，10-2，10-4，10-5稀释度     3.制备上层混合液：制备噬菌体与敏感菌混合液，即在标明10-1，10-2，10-2，10-4，10-5共5支无菌试管中分别各加入0.2ml培养至对数期的大肠杆菌菌液，然后在各对应试管中加入相应稀释度的噬菌体液0.1ml后混匀，37℃保温5min，带噬菌体吸附侵入寄主细胞     4.倒上层半固体琼脂平板：在上述各噬菌体和敏感菌的混合管中各加入3.5ml约50℃左右的上层牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基，立即摇动试管使培养基与菌液充分混匀，并对号倒在含有底层琼脂平板的表面，迅速铺平待凝。

     5.培养：待上层琼脂凝固后，将平板倒置于37℃恒温箱中培养周三下午：     6.观察实验结果（具体结果见后面分析）     7.清洗整理实验用具实验结果及分析】     1.大肠杆菌斜面结果：“z”型线清晰均匀，斜面结果较好        分析：（1）培养基、斜面灭菌彻底，无杂菌生长                 （2）操作时严格按照斜面接种的方法进行      2．验证噬菌体的存在的平板结果：         一、用枪加裂解液的平板（1个）：中央有大面积的透明区，周围有小部分的菌膜         二、用接种针加裂解液的平板（2个）：平板上出现明显的噬菌斑：透明，约8mm左右的圆形噬菌斑，对照区域无噬菌斑      分析：         一、因所用的枪的最小量程为0.1ml，所以用枪加裂解液量过大，以致大面积的区域没有大肠杆菌，但周围有部分菌膜，说明有噬菌体存在，但既无噬菌斑有无对照，说服力不够强         二、（1）平板上有 噬菌斑，对照区无 噬菌斑，充分证明所取材料中有噬菌体存在               （2）验证噬菌体存在时，滴加裂解液的量不宜过多，以免影响结果的观察从而影响判断。

     3.噬菌体纯化的平板结果           平板表面没有成片的菌膜，也没有噬菌斑，但有分布基本均匀、为数不多的菌苔：呈直径约1mm左右的淡黄色圆形（5个平板现象一致）           分析：               （1）    在验证噬菌体是否存在时，出现了明显的噬菌斑，证明所取材料中有噬菌体存在，噬菌斑的周围是大肠杆菌菌膜，同时也说明敏感菌悬液浓度合适               （2）    平板表面有少量菌苔，而前面已证明敏感菌悬液浓度合适，不是很低，说明有部分大肠杆菌死亡，而无噬菌斑出现，既说明死亡大肠杆菌不是噬菌体所致，也说明噬菌体死亡，所以应在操作步骤中找原因               （3）    在倒上层平板这一步中，半固体培养基在电炉上水浴融化后置于50℃的水浴锅保温，由于其他操作已经完成，实验时不够严谨，保温时间过短，大约3分钟就拿出来，直接加到上层混合液中，刚刚煮沸的半固体培养基在50℃的水浴锅中放置3分钟不足以使其自身温度降低至50℃左右，高温烫死了几乎所有的噬菌体和大部分的大肠杆菌，只有少数大肠杆菌存活了下来实验心得】      由于不够严谨，致使实验结果不尽如人意，后续的实验，我们没再进行，说实话有点“不甘心”。

但本次综合实验意义重大，我收获不少，通过自己查阅资料、自己整理实验方案、自行安排并完成实验，使我对微生物甚至生物学实验有了系统的了解，通过具体的实验过程，更深入的掌握微生物学实验的基本原理和操作方法，培养自己的无菌意识，在今后的实验中应更加细心严谨，不断进取。