5’race 的实验方法

2・2・3・3 5r RACE获得5f端序列根据已知的中间序列设计特异引物Cu3和Cu4，进行5，RACE PCR过程如 下：1、cDNA 纯化(1)取60卩1反转录产物于1.5离心管中，向其中加入5倍体积的结合液PB,充 分混匀2)将(1)所得溶液加入吸附柱中，室温放置 2 min， 12000 rpm 离心 1 min， 弃滤液3) 向将吸附柱中700卩1的漂洗液PW，12000 rpm离心1 min,弃滤液4) 向将吸附柱中500卩1的漂洗液PW，12000 rpm离心1 min,弃滤液5) 12000 rpm离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱开盖置于室温放置数分 钟，彻底晾干6) 将吸附柱安置于新的1.5 ml的离心管中，向吸附柱膜的中央悬空加入30-50卩1的预热到60 °C的洗脱缓冲液EB，室温放置2 min2000 rpm离心2min收 集 cDNA 溶液2、cDNA 的末端加尾(1)在1.5 mLEppendorf中配制下列反应液，全量为50卩1：纯化的 cDNA25卩15xTdT Buffer10卩10.1%BSA5卩110mM dCTP（终浓度 0.5mMd）2.5 卩1TdT15 UddH2OUp to 50 卩1(2) 37C反应10分钟。

4)加入50卩1 (等量)的氯仿/异戊醇(24： 1)，充分混匀5) 离心，取上层移至另一离心管中6) 重复步骤( 4)7) 10000 rpm离心5min，取上层(水层)移至另一离心管中8) 加入125 yl(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20 °C放置1 h； 10000 rpm,离心20min9) 沉淀用70 %冷乙醇清洗沉淀，10000 rpm离心2min,真空干燥10) 加入 20 pl ddH2O 溶解 DNA3、PCR 扩增以纯化加尾的cDNA为模板，Cu3和AAP为引物，做第一轮PCR反应程序如下：10xLA PCR Buffer2.5plMgCl2(25 mM)2.5pldNTP(各 2.5 mM)4plAAP(10pM)1plCu3 (10pM)1plRT product2plLA Taq(5U/pl)0.25pl灭菌 ddH2O11.75plTotal Volume25pl反应程序如下：94°C预变性5 min，然后进行以下循环，94°C变性60 s，56°C 退火 60 s， 72°C 延伸 45 秒，共进行 35 个循环最后 72°C 延伸 10 分钟同样的反应体系和反应程序，以第一次的RCR产物为模板做二次PCR，引 物为 Cu4 和 AUAP。

3．PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳分析将扩增产物回收后连入 pMD18-T， 转入大肠杆菌中，挑单菌落，菌液 PCR 鉴定后，寄往上海博亚生物技术公司测 序。