噬菌体及其研究进展

噬菌体及其研究进展噬菌体及其研究进展Contents噬菌体简介1噬菌体应用技术简介2噬菌体在食品产业中的应用3前景及展望41、噬菌体简介v概念：噬菌体是感染细菌、噬菌体是感染细菌、真菌、螺旋体、支原体、真菌、螺旋体、支原体、立克次体及放线菌等微生立克次体及放线菌等微生物的病毒物的病毒,属非细胞微生物属非细胞微生物v特性：个体微小，需用电镜观察，个体微小，需用电镜观察，可以通过细菌滤器；可以通过细菌滤器；没有完整的细胞结构，由没有完整的细胞结构，由核酸和蛋白质组成；核酸和蛋白质组成；专性活细胞内寄生专性活细胞内寄生,具有严具有严格的寄生特异性格的寄生特异性形态与结构v形态：蝌蚪形，微球形，细杆形蝌蚪形，微球形，细杆形v噬菌体颗粒在结构上有很噬菌体颗粒在结构上有很大差别，一般可分成三种大差别，一般可分成三种类型，即类型，即 无尾部结构的二十面体无尾部结构的二十面体无尾部结构的二十面体无尾部结构的二十面体，有尾部结构的二十面体有尾部结构的二十面体有尾部结构的二十面体有尾部结构的二十面体和和线状体线状体线状体线状体，迄今已知的噬菌，迄今已知的噬菌体大多数是有尾部结构的体大多数是有尾部结构的二十面体。

二十面体头部头部尾部尾部v核酸：DNADNA或或RNA,RNA,基因组大小为基因组大小为2-200kb2-200kb，某些噬菌体基因，某些噬菌体基因组中还含有异常碱基组中还含有异常碱基大多数为线状双链 DNA噬菌体 少数为环状单链 多数为线状单链 RNA噬菌体 少数为线状双链化学组成v核酸：DNADNA或或RNA,RNA,基因组大小为基因组大小为2-200kb2-200kb，某些噬菌体基因，某些噬菌体基因组中还含有异常碱基组中还含有异常碱基大多数为线状双链 DNA噬菌体 少数为环状单链 多数为线状单链 RNA噬菌体 少数为线状双链v按与宿主的相互关系，噬菌体可以分为两种类型：按与宿主的相互关系，噬菌体可以分为两种类型：烈性噬菌体，温和噬菌体（溶原性噬菌体）烈性噬菌体，温和噬菌体（溶原性噬菌体）烈性噬菌体，温和噬菌体（溶原性噬菌体）烈性噬菌体，温和噬菌体（溶原性噬菌体）烈性噬菌体:能能在在宿宿主主菌菌内内复复制制增增殖殖，产产生生许许多多子子代代噬噬菌菌体，并最终裂解细菌体，并最终裂解细菌温和噬菌体（溶原性噬菌体）：噬噬菌菌体体基基因因组组整整合合于于宿宿主主菌菌染染色色体体中中，不不产产生生子子代代噬噬菌菌体体，也也不不引引起起细细菌菌裂裂解解，但但噬噬菌菌体体DNADNA随随细细菌菌基基因因组组的的复复制制而而复复制制，并并随随细细菌菌的的分分裂裂而分配至子代细菌的基因组中。

而分配至子代细菌的基因组中生物合成装配释放烈烈性性噬噬菌菌体体的的溶溶菌菌周周期期2、噬菌体的应用技术应用鉴定细菌分型测定辐射剂量检测基因产物的活性筛选目的基因 检测病原菌预防和治疗传染性疾病3、噬菌体在食品产业中的应用v食源性疾病病原的检测技术v作为食品添加剂v噬菌体展示技术检测真菌毒素3.1食源性疾病病原的检测技术食源性疾病病原的检测技术是食源性疾病的预防与控制的关食源性疾病病原的检测技术是食源性疾病的预防与控制的关健的技术环节数据显示，每年大约有健的技术环节数据显示，每年大约有7600 7600 万人因食用了万人因食用了受污染的食物而患病，其中受污染的食物而患病，其中91%91%是由于细菌污染造成是由于细菌污染造成现存的检测方法包括传统的细菌分离培养法、多聚酶链式反现存的检测方法包括传统的细菌分离培养法、多聚酶链式反应应(PCR)(PCR)法、生物芯片技术和免疫学方法等法、生物芯片技术和免疫学方法等缺点缺点：费时费力、价格昂贵、特异性或灵敏度低、国内试剂：费时费力、价格昂贵、特异性或灵敏度低、国内试剂供应不配套等，很难适应公共卫生事件应急处理快速反应的供应不配套等，很难适应公共卫生事件应急处理快速反应的需要。

需要有必要寻找一种简捷、快速、灵敏度高的检测食源性病原微有必要寻找一种简捷、快速、灵敏度高的检测食源性病原微生物的方法以及技术平台生物的方法以及技术平台检测方法报告基因检测报告基因检测荧光染料标记染料标记噬菌斑检测检测3.1.1噬菌斑检测v原理：用噬菌体截获某种：用噬菌体截获某种病原菌，随后病原菌被噬病原菌，随后病原菌被噬菌体感染，用杀毒剂将胞菌体感染，用杀毒剂将胞外的剩余噬菌体杀死，然外的剩余噬菌体杀死，然后将噬菌体与被感染细胞后将噬菌体与被感染细胞混合并在装有软琼脂的双混合并在装有软琼脂的双层培养基上培养，被感染层培养基上培养，被感染的细胞破裂释放出子代噬的细胞破裂释放出子代噬菌休，在培养基中就会形菌休，在培养基中就会形成空斑实验方法v标本采集后置于标本采集后置于SC SC 增菌管中增菌管中37 37 增菌增菌18 h18 h左右左右,SS,SS 平平板分离培养板分离培养37 37 过夜过夜,然后挑出具有然后挑出具有沙门氏菌沙门氏菌特征的单特征的单个菌落划线接种于普通琼脂平皿上个菌落划线接种于普通琼脂平皿上,每块平板划格后可接每块平板划格后可接种种8 8 个菌落左右个菌落左右v在每格中央用灭菌的毛细滴管滴上在每格中央用灭菌的毛细滴管滴上O-IO-I噬菌体噬菌体,待溶液干待溶液干后置后置37 6-8 h 37 6-8 h 培养或过夜培养或过夜,观察噬菌体裂解情况。

观察噬菌体裂解情况v发现被发现被O-I O-I 噬菌体裂解的菌株噬菌体裂解的菌株,马上挑取噬斑周围菌苔直马上挑取噬斑周围菌苔直接做沙门氏菌接做沙门氏菌A-F A-F 多价血清凝集试验多价血清凝集试验,凝集阳性者即可凝集阳性者即可初步报告结果初步报告结果,然后转种克氏双糖铁管作进一步鉴定分型然后转种克氏双糖铁管作进一步鉴定分型简例vO-IO-I噬菌体是作用于沙门氏菌属特异性噬菌体噬菌体是作用于沙门氏菌属特异性噬菌体,染色体为双染色体为双链链DNA,DNA,受体是宿主细胞壁上核心多糖的乙酰氨基葡萄糖受体是宿主细胞壁上核心多糖的乙酰氨基葡萄糖应用应用O-IO-I噬菌体进行饮食行业及公共场所从业人员带菌调噬菌体进行饮食行业及公共场所从业人员带菌调查结果表明查结果表明,沙门氏菌检出率为沙门氏菌检出率为0.131%,0.131%,与广东省报道与广东省报道的的0.134%0.134%检出率相近检出率相近,说明说明O-I O-I 噬菌体应用对沙门氏菌噬菌体应用对沙门氏菌的诊断具有较高的特异性和敏感性的诊断具有较高的特异性和敏感性,不失为大量从业人员不失为大量从业人员沙门氏菌调查的较为理想快速诊断方法沙门氏菌调查的较为理想快速诊断方法。

3.1.2荧光染料标记法v原理：选选用用一一种种合合适适的的染染色色剂剂，噬噬菌菌体体的的核核酸酸染染色色标标记记，然然后后用用标标记记过过的的噬噬菌菌体体侵侵染染相相应应的的宿宿主主菌菌，噬噬菌菌体体吸吸附附在在宿宿主主菌菌表表面面后后，随随即即将将标标记记过过的的核核酸酸注注入入宿宿主主细细胞胞，随随着着越越来来越越多多的的噬噬菌菌体体核核酸酸的的注注入入，细细胞胞内内荧荧光光随随着着荧荧光光素素的的增增多多而而增增强强，借借助助荧荧光光显显微微镜镜便便能能判判定定宿宿主主菌菌的的存存在在，从从而实现病原菌的检测而实现病原菌的检测简介A图只有细菌,荧光视野里不见任何发光物质;B图中只有荧光标记O-I噬菌体,视野下偶尔可见少量圆点状的荧光物质,不见菌形;C图是荧光标记O-I噬菌体和沙门氏菌混合,可见大量杆状物,少量点状物,极少数彗星状杆状物,将杆状物质与沙门氏菌的革兰氏染色形态进行比较,两者一致由此可推知,C图中杆形物是侵有荧光噬菌体的沙门氏菌,点状物是标记的O-I噬菌体,结合B图可知彗星状杆形物是即将裂解的宿主菌简例v蒋鲁岩等用此方法快速检测食品源沙门氏菌，检测灵敏度蒋鲁岩等用此方法快速检测食品源沙门氏菌，检测灵敏度达达10 CFU/100L;12010 CFU/100L;120份食品样品中沙门氏菌的份食品样品中沙门氏菌的O-IO-I噬菌体噬菌体检测与生化鉴定结果的阳性率分别为检测与生化鉴定结果的阳性率分别为9.17%9.17%和和10%,10%,符合率符合率为为91.7%91.7%。

表明用荧光标记的表明用荧光标记的O-IO-I噬菌体可以快速、直观、噬菌体可以快速、直观、准确、大量地检测食品中沙门氏菌准确、大量地检测食品中沙门氏菌3.1.3报告基因检测技术v该该技技术术中中，将将一一个个报报告告基基因因通通过过噬噬菌菌体体插插入入到到目目标标菌菌体体的的D D N N A A 中中，随随着着报报告告基基因因的的表表达达，目目标标菌菌体体便便可可快快速速得得到到检测v应应用用在在这这一一技技术术的的报报告告系系统统主主要要有有原原核核生生物物和和真真核核生生物物的的荧荧光光素素酶酶(lux,luc)(lux,luc)基基因因，细细菌菌冰冰核核蛋蛋白白(inaW)(inaW)基基因因，E.coli-E.coli-半半乳乳糖糖苷苷酶酶(lacZ)(lacZ)基基因因和和生生物物素素亲亲和和蛋蛋白白报报告告 噬噬 菌菌 体体 已已 经经 能能 够够 成成 功功 检检 测测 许许 多多 菌菌 种种，如如E.coli,Salmonella.spp E.coli,Salmonella.spp 等等 简介利用荧光素酶基因作为报告基因的快速检测技术对于细菌来说，发光机理可用下式表述：对于细菌来说，发光机理可用下式表述：F M N H 2+R C H O+O 2 F M N+H 2O+R C O O H+h(490nm)反应是在荧光素酶的催化下进行的。

细菌的荧光素酶是一个反应是在荧光素酶的催化下进行的细菌的荧光素酶是一个7 7 k D 7 7 k D 的的二聚体，其中包含二聚体，其中包含亚基亚基(4 0 3 7 k D)(4 0 3 7 k D)和和亚基亚基(37kD)(37kD)目前，生物发光基因目前，生物发光基因(lux,luc)(lux,luc)在报告噬菌体检测技术中应用最为广泛在报告噬菌体检测技术中应用最为广泛Waddell Waddell 等利用转座子致突变，将等利用转座子致突变，将lucAlucA和和lucBlucB基因插入到基因插入到E.coli E.coli O157:H7O157:H7的温和噬菌体的温和噬菌体 V 1 0 V 1 0 中，构建了一个荧光素酶转座噬菌体，中，构建了一个荧光素酶转座噬菌体，这一噬菌体能够使这一噬菌体能够使E.coli O157:H7 E.coli O157:H7 在在1h 1h 内被成功检测，并报告出结果内被成功检测，并报告出结果vMasahitoMasahito等将绿荧光蛋白等将绿荧光蛋白(GFP)(GFP)基因分别插入到基因分别插入到T T偶数型噬菌体偶数型噬菌体PP01 PP01 的外壳蛋白的外壳蛋白(SOC)(SOC)基因的基因的C C 末端和末端和N N 末端，构建成噬菌体末端，构建成噬菌体PP01-GFP/SOC PP01-GFP/SOC 和和PP01-SOC/GFPPP01-SOC/GFP，这种对，这种对E.coli O157:H7E.coli O157:H7特异的噬菌体能够成功检测菌特异的噬菌体能够成功检测菌体的可培养细胞，不可培养但可存活细胞体的可培养细胞，不可培养但可存活细胞(VBNC)(VBNC)及经过巴氏消毒过的细及经过巴氏消毒过的细胞，灵敏度高，检测时间仅为胞，灵敏度高，检测时间仅为20min20min。

以-半乳糖苷酶作为报告基因的快速检测技术-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)(EC 3.2.1.23)是一种催化是一种催化-半乳糖苷水解半乳糖苷水解反应的糖苷酶反应的糖苷酶半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的作作用用特特性性是是随随着着水水解解反反应应底底物物的的不不同同而而改改变变，邻邻硝硝基基苯苯-D-D-半半乳乳糖糖苷苷是是检检测测中中常常用用的的灵灵敏敏基基质质，它它被被-半半乳乳糖糖苷苷酶酶水水解解后后产产生生蓝蓝色色沉沉淀淀，该该技技术术可可以以使使检测的灵敏度达到生物发光荧光素酶检测的水平检测的灵敏度达到生物发光荧光素酶检测的水平GoodridgeGoodridge等等设设计计了了一一个个带带有有lacZlacZ基基因因的的T4T4噬噬菌菌体体，用用这这种种噬噬菌菌体体感感染染待待测测样样品品，并并用用化化学学发发光光基基质质作作为为检检测测基基质质，研研究究人人员员成成功功检检测测了了肉肉汤汤培培养养基基中中的的E.coliE.coli，检检测测限限仅仅为为10102 2CFU/mlCFU/ml然然后后，研研究究人人员员将将最最大大概概率率数数(most(most probable probable numbernumber，MPN)MPN)法法应应用用到到食食源源性性病病原原菌菌检检测测中中，检检测测水水平平可可降至降至10CFU/ml10CFU/ml，用时仅，用时仅1h1h。

3、噬菌体在食品产业中的应用v食源性疾病病原的检测技术v作为食品添加剂v噬菌体展示技术检测真菌毒素3.2作为食品添加剂美美国国食食品品和和药药物物管管理理局局批批准准了了一一种种由由噬噬菌菌体体病病毒毒混混合合而而成成的的产产品品，主主要要用用于于杀杀灭灭肉肉制制品品中中的的李李氏氏杆杆菌菌这这是是美美国国首首次次批批准准将将病毒用作食品添加剂病毒用作食品添加剂美美药药管管局局专专家家称称，该该产产品品在在制制备备过过程程中中可可能能留留有有残残毒毒，但但试试验验表表明明，这这些些微微量量的的残残毒毒不不会会引引起起任任何何健健康康问问题题该该产产品品包包含含6 6种种噬噬菌菌体体病病毒毒，可可在在熟熟肉肉片片和和香香肠肠等等包包装装前前喷喷洒洒在在这这些些肉肉制制品品上上，有有效效杀杀灭灭多多种种李李氏氏杆杆菌菌，预预防防由由这这些些细细菌菌引引起起的的食食物物中中毒毒产产品品中中所所包包含含的的噬噬菌菌体体只只会会攻攻击击李李氏氏杆杆菌菌，对对人人体体和和植植物物细细胞胞都不会产生影响都不会产生影响3、噬菌体在食品产业中的应用v食源性疾病病原的检测技术v作为食品添加剂v噬菌体展示技术检测真菌毒素3.3噬菌体展示技术检测真菌毒素v噬菌体展示技术噬菌体展示技术(Phage display technology)(Phage display technology)是是20 20 世纪世纪80 80 年代逐步建立并发展起来的一项分子生物学新技术。

年代逐步建立并发展起来的一项分子生物学新技术它以噬菌体或噬粒为载体它以噬菌体或噬粒为载体,使外源肽或蛋白基因与噬菌体使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达,进而通过亲和进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体真菌毒素作为天然毒素广泛存在于谷物等食品中，世界很多国家真菌毒素作为天然毒素广泛存在于谷物等食品中，世界很多国家均有被污染的报告，由于真菌毒素属于痕量污染物，因此检测技均有被污染的报告，由于真菌毒素属于痕量污染物，因此检测技术主要有各类色谱法和利用抗体的免疫学方法术主要有各类色谱法和利用抗体的免疫学方法其中其中高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）、气相色谱和质谱联用（）、气相色谱和质谱联用（GC-MSGC-MS）优点优点：灵敏度和可靠性都很高：灵敏度和可靠性都很高缺点缺点：样品处理繁琐，仪器昂贵，现场快速检测中难以普及使用：样品处理繁琐，仪器昂贵，现场快速检测中难以普及使用酶联免疫吸附检测技术酶联免疫吸附检测技术(ELISA)(ELISA)优点优点：可以同时大批量检测样品，携带方便，操作简便和经济：可以同时大批量检测样品，携带方便，操作简便和经济,常以试剂盒的形式出现且易商品化常以试剂盒的形式出现且易商品化缺点缺点:目前用于目前用于ELISA ELISA 检测试剂盒的各类毒素的单克隆抗体检测试剂盒的各类毒素的单克隆抗体(McAb)(McAb)主要来源于小鼠杂交瘤细胞，在筛选单克隆抗体生产杂主要来源于小鼠杂交瘤细胞，在筛选单克隆抗体生产杂交瘤细胞株系上，需要做杂交融合，亚克隆筛选，是一个长期复交瘤细胞株系上，需要做杂交融合，亚克隆筛选，是一个长期复杂的过程，既耗费财力、物力，又浪费时间，且检测所用真菌毒杂的过程，既耗费财力、物力，又浪费时间，且检测所用真菌毒素标准品价格昂贵。

素标准品价格昂贵v利利用用噬噬菌菌体体展展示示技技术术制制备备抗抗体体、模模拟拟抗抗原原表表位位，不不仅仅绕绕过过了了细细胞胞融融合合，而而且且可可以以以以单单克克隆隆抗抗体体（McAbMcAb）或或单单链链抗抗体体（ScFvScFv）为为靶靶分分子子筛筛选选真真菌菌毒毒素素的的模模拟拟抗抗原原表表位位，代代替替真真菌菌毒毒素素的的标标准准品品，建建立立无无毒毒ELISAELISA检检测测方方法法，保保证证实实验操作人员和相关研究人员的人身安全验操作人员和相关研究人员的人身安全v 熊熊 啸啸（2007 2007 年年）等等 选选 用用 抗抗 黄黄 曲曲 霉霉 毒毒 素素 M1M1（anti-anti-AFM1,Aflatoxin AFM1,Aflatoxin M1,AFM1M1,AFM1）单单克克隆隆抗抗体体为为筛筛选选配配基基，从从噬噬菌菌体体表表面面展展示示的的随随机机7 7 肽肽库库中中筛筛选选出出AFM1 AFM1 抗抗原原的的模模拟拟表表位位LTSFPRH LTSFPRH 和和MAPSSWRMAPSSWR，为为研研制制出出安安全全无无毒毒的的ELISA ELISA 试试剂剂盒奠定基础。

盒奠定基础4、前景及展望v噬菌体检测技术具有快速、准确而直观特点噬菌体检测技术具有快速、准确而直观特点,具有很强的具有很强的优势优势,应用前景广阔应用前景广阔v噬菌体大规模应用技术尚不成熟噬菌体大规模应用技术尚不成熟,有关噬菌体的各种研究有关噬菌体的各种研究正在开展正在开展,但是这些研究仍限于动物模型但是这些研究仍限于动物模型,且缺少统一的评且缺少统一的评定指标噬菌体技术存在很多缺陷，比如定指标噬菌体技术存在很多缺陷，比如:噬菌体携带一噬菌体携带一些毒素基因些毒素基因;噬菌体裂解细菌高度特异噬菌体裂解细菌高度特异,作用谱很窄这些作用谱很窄这些问题会导致实际过程中治疗的不稳定性和不安全性问题会导致实际过程中治疗的不稳定性和不安全性v所以目前噬菌体在实践中的应用相对较少所以目前噬菌体在实践中的应用相对较少,研究空间较大研究空间较大相信随着噬菌体技术的不断发展和改善相信随着噬菌体技术的不断发展和改善,它将在生命科学它将在生命科学等各个领域产生深远的影响等各个领域产生深远的影响。