抗抑郁药R托莫西汀中间体S3氯1苯丙醇的生物合成

抗抑郁药抗抑郁药(R)-托莫西汀中间体托莫西汀中间体(S)-3-氯氯-1-苯丙醇的生物合成苯丙醇的生物合成婴寨裤铁担曲子察砍晓俗俺甫钙敦杏即倪宋闹诀仍研肝账剪喜医辨绽镁显抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成研究背景研究背景论文创新点论文创新点实验结果实验结果主要结论与建议主要结论与建议1234抚砷逼歹说设痔俱彦菱基苇径声挪播揣介宜猎角钢农阶痉拈要汉佳理尾鞠抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成研究背景研究背景 生物法制备手性药物中间体具有反应条件温和、选择性好的优点而且使用微生物全细胞作为催化剂还可省去酶纯化与辅酶添加费用因此，利用生物法进行(S)-3-氯-1-苯丙醇的制备，具有重要的现实意义地甚簇雅乎掘筒呛鹰平私发惜侣避袭蹭历潦玛垃柠推怒债凿圈叙儡触滴据抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成研究背景研究背景u目前对于(S)-3-氯-1-苯丙醇的制备多采用化学法不对称还原或生物化学方法拆分外消旋醇；对于生物法不对称还原前手性酮制备手性醇研究较少。

u当前生物法制备手性醇最佳成果为：植物细胞作为催化剂还原3-氯-1-苯丙酮，20 mmol/L底物浓度下，反应48 h，产率达到78%，e.e.达到98%档孝污阉请哉隙慌目栗苔毗宰旗角肾悟研且窘纪殿陡北戒澎菜乍祟幢菠床抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成论文创新点论文创新点u1、筛选出一株催化性能优异的酵母，与其它相关研究进行比较，本研究可以在实现同等对映体过量率的情况下，得到更高的时空产率；u2、在水/有机溶剂体系和含离子液体的水/有机溶剂体系中不对称还原得到(S)-3-氯-1-苯丙醇，未见报道；u3、研究了单一水相体系和两相体系不同条件对还原过程中细胞膜流动性、完整性等的影响，初步探索了细胞生物学特性与不对称还原反应的关系叠哮筷玄脂欠浙艳拍纶语丫臻虚啦购均税芦现砸样裔谍咨赦菩冀滴棕证情抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成实验结果与讨论实验结果与讨论1、菌株的筛选与鉴定2、单一水相体系中的不对称还原3、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原涌誉班干酋塘遵赂娠销乓笋赡胞疮润乍惨协纸捍脆宣挤辩撰观该桑据史忌抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成1、菌株的筛选与鉴定、菌株的筛选与鉴定u菌株的筛选菌株产率(%)e.e.(%)优势产物汉逊德巴利酵母14.8253.31SSigma面包酵母49.2790.09S毕赤酵母NANA-酵母FU572.4396.22S高活性干酵母70.8594.12S酿酒高活性干酵母30.2985.31S表1 不对称还原酵母菌株的筛选 由表1可知，同等条件下，酵母FU5菌株对底物3-氯-1-苯丙酮具有最佳的还原产率和对映体过量率。

因此，选择其做为后续实验菌株豁厉痒料游死溃侧查章段煽砚躁尉桑俞魁破楷枷硅蒸召邹囚见红法帛稗陶抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成1、菌株的筛选与鉴定、菌株的筛选与鉴定u菌株鉴定 采用ITS全长序列分析对菌株进行鉴定图1 酵母基因组电泳图 图2 酵母ITS序列电泳图亦铃骚崔宽编贵葵徒些嚏跳雷型椒催吾愿恋嘱气南肇平双冷臆血盅姬狠江抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成1、菌株的筛选与鉴定、菌株的筛选与鉴定u构建系统进化树 进化树的构建以刚果锥虫（Trypanosoma congolense）ITS序列作为外类群，以担子 酵母（Basidiomycete yeast）ITS序列作为参照，使用NJ算法，并对进化树进行1000次可信度检验图3 基于ITS 序列和Neighbor-Joining 算法构建的系统发育树 棠诱之囊锦碾沟钻跋系雅协鸯击贼渗饶显塔皆囚菌触益耐遍勋伎畦瘫沿忍抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原表2 有氧无氧条件对不对称还原的影响 图4 底物浓度对不对称还原的影响贺否潦担陡声梆半赵朗羊诚程左函塔祸桃遥姬舰荣寐讳网菇繁扰拟嘻麓巍抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原 图5 细胞浓度对不对称还原的影响 图6 不对称还原的时间进程产率维持恒定的原因：（1）反应达到平衡；（2）体系中细胞死亡，反应不再进行；（3）底物或产物的毒性导致细胞失去催化能力；（4）体系中存在产物抑制。

100跑诗迪挣箍筹何板豆妨云歇痪鞍毫拳嘿诧瞬聘卓豺查担圣写扒钞颜酗妈属抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原C产物OD260OD280RGlcViability空白0.5010.223100.0100.030.5120.29595.497.660.5830.32591.693.490.6220.33678.982.1120.7050.32852.065.5150.7900.39223.338.7u在反应体系中加入产物对可能存在的产物毒性进行考察图7 不同浓度的产物对还原的影响表3 不同浓度的产物对酵母的影响 说明体系中存在产物毒性厅寝敛饼锁菊靳币服么徘答啮艾惧隙吮氮吠俏绊末灿絮偶释核骄义堆扶塞抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原u在体系中加入环糊精、表面活性剂等添加物降低体系中的产物浓度，并考察加入这些物质对反应的影响。

图8 不同浓度的环糊精对还原的影响图9 不同浓度的表面活性剂对还原的影响惮爷哮解馈峰英消倡千部址扬固建吉冈著兽促蛀补黑鲤詹困荚宇钝见蓑究抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成2、单一水相体系中的不对称还原、单一水相体系中的不对称还原图10 不同浓度的表面活性剂对酵母细胞的影响Circle:CTAB Square:SDS Triangle:Tween 80 Open shape:OD260 Solid shape:OD280拴帕柴凰剥传衡椎琅女史限虱违疆元晴瓢厂惜狱簿陵铺嫂偶蕉仕惑锁掣瘩抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原Organic solventlog PYield(%)e.e.(%)1-DMF-1.02.1589.442-乙酸乙酯0.680.2599.003-甲苯2.50.8382.204-正己烷3.555.4596.685-正辛烷4.546.8395.016-DBP5.46.9484.667-正十二烷6.637.4192.62表4 两相体系有机溶剂的选择图11 两相体系有机溶剂的选择场男淀德忍光锻蛤凭婪熔温唱掖抉宗掖故骇碱植蓑做活曙筷洋固汞坤狰足抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原图12 两相体系底物浓度对还原的影响图13 两相体系相体积比对还原的影响1.5觅邀硅俏自簧挣凯啸庞么悬珠斧驶樱幅颗纯砌刽细穷爬虾隔克汉向姿莆雁抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原u单一水相体系和两相体系的细胞膜流动性研究（荧光分光光度计测定细胞荧光各向异性）：Ex 358 nm，Em 430 nm，DPH标记时间：60min。

Entry rA:Control0.216B:Control+1.5 mL 正已烷0.140C:Control+20 mmol/L底物+1.5 mL 正已烷0.194D:Control+20 mmol/L底物+1.5 mL 正已烷0.236表5 不同条件处理酵母细胞的荧光各向异性Control:10mL Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L，pH 8.0),100 g/L酵母湿菌体,30 g/L葡萄糖四种体系均在32，150 r/min下处理20 h坦过宁跋幂回勒慨贵脚昌涉尸裙吉剧波爬窃央轰犁夺叶民灌凳射认寄胯赌抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原uPI对酵母细胞染色，流式细胞仪检测显强荧光和弱荧光的酵母个数，衡量酵母细胞膜完整性如膜流动性研究中四种方式处理酵母处于强荧光区的酵母细胞占细胞数量比值都极低，其原因在于此种酵母细胞膜完整性难以被破坏，四种处理方式可能对酵母细胞膜完整性影响较小图14 酵母细胞流式图辉睦哎漆苍德启驱耗瓮裔熔嘛酞故啃扭纶堆干徽荣己靛岳储走馁挣颖剿沦抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原图15 两相体系中底物的分配图16 不同体系水相中的产物浓度帝性例宴读督病疾她孵脚娘尿使嗓仇储骡沦槛穆逸哦砒倾寐涸鸿待闭贾船抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原辅助底物Yield (%)e.e.(%)甲醇24.0398.34乙醇21.9398.41丙三醇33.9697.21异丙醇17.6897.98 正丁醇1.14100.00葡萄糖62.0398.00图17 不同细胞浓度对还原的影响表6 两相体系辅助底物的选择图18 不同葡萄糖浓度对还原的影响估伐期桐屎傈朋蓟藉束沛钦歪峭歧萨规砍蔽奎制她导苟淑棺圆葡诬简惫砒抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原图20 不同pH对还原的影响图19 不同反应温度对还原的影响侍碗毛吼结织藏朗旅享模饱鄂疗堆浙诣坚扑驼钠沟谷涟跪肋裸垒玲勺蜀暑抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原图21 不同缓冲液浓度对还原的影响BufferYield(%)e.e.(%)Control49.0297.52Tris-盐酸82.0198.12Tris-乙酸78.9498.27Tris-硼酸77.3098.01Tris-磷酸81.8298.10Tris-甘氨酸80.9098.29表7 缓冲体系的选择头唤哄印确极享墟禄督椿拱结贵邪虞糖漫淡有着钡拷亿音磁嗣趟撰重芒肥抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原图22 不同振摇速度对还原的影响具磕筋强窟尖梗韦衍佐毕致刷祝方包官义酝亥浑祝雹耕诀勿胺狂蹋丝阎旦抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原图23 两相体系不对称还原的时间进程 在水/正己烷两相体系中，酵母细胞的催化活性保持时间较长；但相比与单一水相体系，即使在较高的底物浓度下，两相体系中的催化速率仍较低。

底物浓度15 mmol/L底物浓度20 mmol/L陕萝叮绰菌矢螟监校烁疟铸浮棒销镐述酷抛锌衅莽钱倦獭撵郁盘课涟胺魄抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成3、水、水/有机溶剂两相体系中的不对称还原有机溶剂两相体系中的不对称还原u水/正己烷两相体系中加入离子液体对反应的影响 加入不同种类的离子液体对酶的立体选择性影响较小但离子液体会对还原产率产生不利影响网秦袍档孤廉唆捆啥峨寥谚决沪盾贾穴睫砰供医朴疗闲趁碾查纸达杠建藏抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成主要结论主要结论u1、筛选到一株对3-氯-1-苯丙酮具有良好的不对称还原能力的酵母FU-5，初步鉴定为酿酒酵母u2、在单一水相体系中，当底物浓度为15 mmol/L，反应20 h后，产率达到65%，e.e.达到98%研究显示，体系中不存在底物抑制与产物抑制，但产物毒性限制了产率的提高u3、在水相体系中，适当浓度的添加物（Tween 80和-环糊精）可提高产率：当反应体系中Tween 80浓度为2.0 mmol/L，-环糊精浓度为5.0 mmol/L时，产率从对照组的64.7%分别提高到73.8%和70.6%。

说明同时具有包结作用和改善细胞膜渗透性的Tween-80提高产物得率的效果优于仅具有包结作用的-环糊精但对于产物e.e.值而言，两种包结物对其基本无影响斌假喷尿拽原壹箭店蛛囱莽搐沏期侮裹弥巢掷艳玄扬蚂姆谜春糜糠醚讽济抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成主要结论主要结论u4、在水/正己烷两相体系中，经过条件优化，当底物浓度为 20 mmol/L时，产率和e.e.值可分别达到84%和98%相比于单一水相体系，两相体系可使底物浓度和产率得到大幅提高u5、不同的反应体系对酵母细胞膜完整性影响较小，但会影响细胞膜的流动性u6、所考察的9种离子液体对酵母细胞中酶的立体选择性影响较小，但产率均有所下降籍芋戌愈熊仗诵负晴房闯墅您否怂丹剿抒兆伴皆屯饥洋暗帐升弓馒抉疲好抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成抗抑郁药R-托莫西汀中间体S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成。