PCR实验操作流程

PCR实验操作流程（TB/LP/MPCP）一、标本的核酸提取（痰标本）1、 痰液液化：痰液加入四倍体积的4%NaOH，摇匀静置30min； （样本编号，离心管编号）2、 将液化后的液体0.5ml转至1.5ml离心管中，再加入0.5ml 4%NaOH，混匀静置 10min继续液化，13000rpm离心5min，去上清;3、 加入1ml生理盐水洗一次，振荡器震荡混匀，13000rpm离心5min，上清去除 干净；4、 沉淀直接加入100原核酸提取液（提取液使用之前混匀），混匀数秒，干热仪 100°C加热10min，然后13,000rpm离心5min，取上清4口作为PCR反应模板二、试剂配制、加样、PCR 扩增设置扩增循环参数设置:37CX2min，94CX2min，循环一次;93CX15s, 60CX60S， 循环40次，荧光检测在60CX60S，荧光通道FAM和VIC通道反应体系40口 四、结果判断MPCP： FAM通道Ct W38，报告MP为阳性；VIC通道Ct W38,报告CP为阳性；如 果 Ct 值在 38-40 之间，复检一次，如果 Ct 显示仍在 38~40 之间，则判断为低于检测 线，判为阴性LP： FAM通道Ct W38，报告LP为阳性；如果Ct值在38-40之间，复检一次，如 果 Ct 显示仍在 38~40 之间，则判断为低于检测线，判为阴性TB： FAM通道Ct W38，报告TB为阳性；如果Ct值在38-40之间，复检一次，如 果Ct显示仍在38~40之间，且扩增曲线呈典型的S型，则判断为阳性；若非典型S型 曲线，则判断为低于检测线，判为阴性。