培养基优化设计

课程设计说明书课程名称：新编生物工艺学 设计题目：培养基优化设计 院 系：生物与食品工程学院 学生姓名： 学 号：200806040035专业班级：0 8生物技术指导教师：关现军2011 年 6月3 日课程设计任务书设计题目培养基优化设计学生姓名张学义 所在院系 生物院 专业、年级、班08生物技术设计要求：1、 进 步巩固加深所学《生物工艺学》、《生物工程设备》、《生物工厂设计》、《生物 反应工程》和《发酵工艺学》等专业课程的基本理论和知识，使之系统化、综合化2、 培养学生综合运用基础理论和专业知识解决工程实际问题的能力3、 掌握有关设计手册（如《化工设备设计手册》、《化学工程手册》等）的使用学生应完成的工作：优化出培养墓营养因子最佳组成是：玉米浆3%、牛肉膏1%、乳糖1%研究结果表明，嗜酸 乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌，在优化后的MRS培养基发酵液中，3 7C 培养2 0h，菌落数均高于原MRS培养基发酵液的菌落数，达到1护cumL以上，乳酸菌 发酵液得到了浓缩，大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本，原料成本降低了约40%,冋时使菌种数量达到最大参考文献阅读：【1】 徐中儒•农业试验最优回归设计.北京:农业出版社，1988【2】 贵州农学院.生物统计附试验设计.北京:农业出版社,1983【3】 刘忠敏，林兴兵，杨生玉.现代应用生物技术.北京：化学工业出版社，2004【4】 陶兴元，刘志国，田俊.生物工程概论.北京：化学工业出版社，2005【5】 诸葛健，沈微.工业微生物育种.北京：化学工业出版社，2006【6】 鲍新华.生物工程.北京：化学工业出版社，2008工作计划：用开始两周的时间进行课程设计的实验，包括实验设计、实验准备、实验实施、实验结果的记录 实验的后续补充。

实验全部完成后，进行课程设计的撰写，讨论实验结果，提出问题、解决问题、得出结论与探索 的新方向，完成本次课程设计任务下达日期： 2011年 5月23 日任务完成日期： 2011年 6月 3日指导教师（签名）： 学生（签名）：张学义目 录1•摘要 页码2. 关键字 页码3. 设计背景 页码3.1培养基简介 页码3.2培养基优化设计的重用意义 页码4设计方案 页码4.1原材料制备 页码4.2菌种的选择 页码4.3营养因子的比例设 页码4.4理化条件控制 页码4.5总工艺流程列叙 页码5预期结果 页码6方案实施时可能出现的问题与对策 页码7设计感受 页码7.1关于本方案 页码7.2关于自我 页码8参考文献 页码1摘要以改良MRS发酵培养基为墓础，选择玉米浆、牛肉膏、乳糖、番茄汁、际蛋 白陈等7个营养因子增菌培养乳酸菌进行优化利用L8 （2的7次方）正交实验， 优化出培养墓营养因子最佳组成是：玉米浆3%、牛肉膏1%、乳糖1%研究结 果表明，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌，在优化后的M RS培养基发酵液中，37C培养20h,菌落数均高于原MRS培养基发酵液的 菌落数，达到1护cumL以上，乳酸菌发酵液得到了浓缩，大大降低了乳酸菌发 酵培养墓的成本，原料成本降低了约4 0%,同时使菌种数量达到最大。

2关键字乳酸菌，营养因子，优化培养，最大产菌3.设计背景3.1乳酸菌培养基简介乳酸菌工业产品为菌体本身细胞，因而设计出能增菌的培养基在工业上具有重要意义设计选用工业上佳美低廉的原料，便于降低成本，也有利于降低菌种的适应期，利于增值乳酸菌增菌液配方设计中因营养要求复杂，影响生长的因素多，在实际工作中还应 做其他条件的优化，如增菌液氧化还原电势、pH值、温度等，因工作量大而时间有限，只 能对配方作初步的优化设计为了降低生产成本，在工业应用时可选用乳清和脱脂乳经 蛋白酶水解，用以提高增菌效果，再加入乳糖、啤酒酵母的自溶水解物，在发酵罐内完成 乳酸菌的增菌，罐内可以通入过滤除菌的N2和CO2，以降低反应液氧化还原电势（特别是 保加利亚乳杆菌）若有自动化发酵罐还可通过监测pH值，发酵罐自动注入灭菌的1 mol -INaOH或NH40H液，以中和代谢乳酸培养基（Medium ）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料， 一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等有的 培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。

一般 培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、 阴凉处保存对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放 在2〜6°C的冰箱内由于液体培养基不易长期保管，现在均改制成粉末化学分类：天然培养基（指一类利用动、植物或微生物体包括其提取物制成的培养 基如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等）;组合培养基（又称为合成培养基或综 合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养 基如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等半组合培养基（指一类主要以 化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基例如，马铃薯蔗糖培养基物理分类：液体培养基（一类呈液态的培养基固体培养基（一类外观呈固 态的培养基根据性质又分为固化培养基、非可逆性固化培养基、天然固态培养基、滤 膜半固体培养基（指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态的 培养基脱水培养基（又称预制干燥培养基，指含有除水分外的一切成分的商品培 养基微生物分类：选择性培养基（一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、 物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛 用于菌种筛选等领域。

鉴别培养基（一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物 发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目 的菌菌落的培养基例如，伊红美蓝乳糖培养基（EMB）另外一种就是天然培养基天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一 类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等组织培养技术建立早期，体外培养 细胞都是利用天然培养基但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐 为合成培养基所替代目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进 细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少3.2存在问题目前的培养基虽能进行乳酸菌生产，但是，其有操作复杂、产量小、资源浪费、成 本过高等不足之处3.3培养基优化设计的重用意义合理配置的培养基中各种营养物质成分达到最适比例，PH达到最适，溶解氧也达到 了最适浓度，这样就给微生物创造了最适宜生长的环境条件，并且对环境产生的污染降 到最低，实现了资源的循环利用又能单位时间内生长最多的菌量同时减少了动力设 备与加压设备，大大减少了成本，这对于一个生产企业来说无疑意义重大4.设计方案4・1原材料制备41.1菌种嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌及其混合菌，4.1、2电子天平，酸度计，培养箱，电热恒温水浴锅，高压灭菌锅，放大镜 冰箱4.1，3玻璃仪器试管、三角烧瓶、试剂瓶、刻度吸管、平皿等4.1,4实验室试剂 浓度为1mol/L的NaOH,；体积分数为75%的乙醇；M17合成 培养基、酸化MRS培养基；质量分数为10%脱脂乳液的配制：取150g脱脂奶粉，加 入1350mL的蒸馏水中，配成10%的脱脂乳液，备用4.2菌种的选择4.2.1酸奶的特征微生物菌落计数［9］及菌落形态将样品以十进制稀释后，取适当的 稀释度分别接种，应用选择性培养基倒平板；MRS培养基，在37°C下培养72h,计算 其保加利亚乳杆菌的菌落数；M17培养基，在37C下培养48h，计算其嗜热链球菌的菌 落数。

4.2.2绘制球菌和杆菌及混合菌的发酵曲线取已知含嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌量的牛乳L，在相同的温度下，各取1种 单独培养，同时也使2种菌按一定的比例混合后培养，随着时间的变化分别测定其酸度 值，然后绘制曲线，其操作步骤如下1) 取质量分数10%的脱脂乳液600mL,分装于3个烧瓶中,每个烧瓶装入200mL， 于105 C下高温蒸汽灭菌15min2) 无菌室(超净台)中的分别接种取装有接种菌种牛乳的试管，摇匀里面的 牛乳用吸管吸取含嗜热链球菌的牛乳1mL，注入1个烧瓶中，用吸管吸取含保加利亚 乳杆菌的牛乳10mL，注入第2个烧 瓶中，然后，用吸管吸取含嗜热链球菌的牛乳0.5mL， 同时用吸管吸取含保加利亚乳杆菌的牛乳5mL，一起注入第3个烧瓶中，并均编号(3)将3个烧瓶密封，充分振摇，然后将其都放在42C的培养箱中恒温培养每隔 30min测定1次3个烧瓶中牛乳的酸度做出其酸度随时间变化的曲线测定酸牛乳的酸度(吉尔涅尔度)】取10mL酸牛乳，用20mL的蒸馏水稀释，加入0.5mL体积分数为0.5%的酒精性酚酞 指示剂，以浓度0.1mol/L的NaOH滴定，将消耗的NaOH体积(mL)数乘以10，即 每100mL牛乳中所需要的浓度为0.1mol/L的NaOH的毫升数为1° T，称为1吉尔涅尔 度。

一般牛乳的酸度超过20° T，即可认为该牛乳已开始变酸酸度越高，对热的稳定 性越差，越易凝固120o o o o O0 8 6 4 211£ St) I I I I I I I I I I 0.5 25 40 5.0 6.0 7.0f/h♦-混合菌；—-保加利亚乳杆菌；亠-嗜热链球菌图1嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌及其混合菌发酵曲线由图1可得知，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌单独作为发酵剂时，它们在开始阶段的发 酵速度比混合菌的快，其中，嗜热链球菌的发酵速度又较保加利亚乳杆菌快随着发酵 时间的延长，嗜热链球菌的发酵速度开始减小，保加利亚乳杆菌的发酵的速度也开始 减小，但混合菌的发酵速度逐渐加大，并且在2h后混合菌发酵牛乳的酸度分别超过杆 菌的和球菌的，酸度明显提高；12h后，其酸度远远超过单菌的品尝酸奶时，发现混 合菌发酵的酸奶口感更好.有一上可知混合菌的发酵条件比单菌的更好更有价值，但如何搭配这两种菌使其得到更 加优化的乳酸菌呢？现就设计不同比例的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的发酵条件来 得出使乳酸菌增菌的最佳混合菌的比例绘制不同比例的混合菌发酵曲线：将菌种混合后，在相同的温度下培养，测定菌种的比例，并随着时间的变化分别测定其 酸度值，然后绘制曲线，具体操作步骤如下。

1）取配制好且灭菌的质量分数10%的脱脂牛乳1000mL，分装于5个烧瓶，每瓶 200mL，分别接种第1个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.75mL和含保加利亚乳杆 菌的牛乳2.5mL；第2个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.5mL和含保加利亚乳杆菌的 牛乳5mL；第3个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.8 mL和含保加利亚乳杆菌的牛乳 2mL；第4个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.25mL和含保加利亚乳杆菌的牛乳7.5mL； 第5个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.6mL和含保加利亚乳杆菌的牛乳4mL分别标 注发酵剂1号〜5号2）取接种牛乳的5个烧瓶，每瓶中分别倒出50mL于另一烧瓶中， 编上号培养前，取装混合菌的5个烧瓶中的牛乳，用酸奶的特征微生物菌落计数 法 记数将接种的5瓶牛乳密封后，放在43°C的恒温培养箱里面培养将另5个烧瓶盖上 塞子后，置于43C的水浴锅中，每5min测定5个烧瓶里牛乳的酸度值3）待到水浴 锅中的烧瓶中的牛乳出现凝聚时，将恒温箱中对应的烧瓶取出，测定其酸度，之后置于 4C的冰箱中储存将菌种1和菌种2每隔一段时间从冰箱中取出后，倒出30mL测定 其酸度，然后放回冰箱中继续储存。

4.3营养因子的比例设计表1营养因子优化正交试验因素水平表U（27）因素水平1〔添加量”％水平陕添加雷）/%閨瘵 in-/ 4^f n - ml 7-葡萄糖01乳M0111. 1番茄汁01013. S10. 8马铃薯汁010i匚 □牛肉膏011 j 1玉米浆0317. 9际资白淼0111. 2帕拉金糖01JO. L结果不同营养因子对嗜酸乳杆菌生长关系影响大小顺序为：玉米浆〉马铃薯汁〉 牛肉膏〉乳糖〉际蛋白陈〉葡萄糖〉番茄汁＞帕拉金糖1. 3 正交试验培养基中共取7个营养因子：牛肉膏、乳糖、番茄汁、马铃薯汁、葡萄糖、玉 米浆、际蛋白胨采用7个因子2个位级的正交表L8 （2的7次方）设计试验，接种嗜酸乳杆 菌采用二级发酵试验由7个因子的R值，得出它们作用的主次顺序为：玉米浆＞牛 肉膏〉乳糖〉际蛋白陈〉马铃薯汁〉番茄汁〉葡萄糖，分析得到下表：表3嗜酸乳杆菌营养因子正交试验结果及分析试验号牛肉膏乳糖番茄汁马铃薯汁葡萄糖玉米浆际蛋白腺菌落数/cfu • mL"1菌落数对数log （cA11122124. 7X1088. 67B21221115. 6X109& 75C12222211. 3X10*& 11D22121221. 1X1077. 04E1121122k 1X108& 04F21112213. 7X 10fl7. 59G12111112. 4X1088, 38H22212123” 9X07. 59kx33. 2033. 0531. 6831. 6032. 2133. 3932. 83kt30. 9731. 1232. 4932. 5731. 9630. 7831. 34极差R2. 231, 930.810. 970. 252. 611*49注:表中“1”代表不加，“2”代表添加。

利用正交试验所优化培养基组成（即：玉米浆3%、牛肉膏1%、乳糖1%,加 其他盐），进步用3种乳酸菌进行发酵试验，验证培养基的发酵增菌效果并与MRS 培养基进行比较，分别接种3种乳酸菌，37°C发酵培养2 Oh，用平板计数法（无氧 培养）进行检测，均进行3次发酵，测定发酵液菌落数，结果见表表4 三种乳酸菌发酵液的菌落数 cfu/mL菌种MRS培养基优化MRS培养基L* acidophilus6. 5X10e父 IX 10#S* thremophilus9.3X1065. 6X1O9L, bulgaricus5. 6X10el；4X10^注＜优化MRS培养基是经正交试验优化后所得4.4理化条件的控制1、 温度温度是影响微生物生长的最重要因素之一从微生物整体来看：生长的温度范围 一般在-10 °C〜100 °C极端下限为-30 °C,极端上限为105〜300 °C.微生物不同生理活动要求 不同温度，所以，最适生长温度定发酵速度快、积累代谢产物多一般而言，老龄比幼龄耐热，原核生物比真核生物耐热，非光合生物比光合生物 耐热，结构简单的比结构复杂的耐热，在富含蛋白质的培养基上生长的细菌耐热能力强 最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。

选择最 适温度应该考虑微生物生长的最适温度和产物合成的最适温度最适发酵温度与菌种， 培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关在各种微生物的培养过程中，各个发酵阶 段的最适温度的选择是从各方面综合进行考虑确定的例如，在四环素发酵中，采用变 温控制，在中后期保持较低的温度，以延长抗生素分泌期，放罐前24h提高2—3°C培养， 能使最后24h的发酵单位提高50%以上又如，青霉素发酵最初5h维持30C，6-35h 为25C，36--85h为20C，最后40h再升到25C采用这种变温培养比25°C恒温培养的 青霉素产量提高14. 7%2. pH值的影响微生物的生长pH值范围极广，从pHv2〜＞8都有微生物能生长但是绝大多数种类 都生活在pH5.0〜9.0之间同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程 中，对pH值的要求也不同在发酵工业中，控制pH值尤其重要,同一种微生物在不同 的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值要求不同微生物生长最适pH与产物形成最适pH相互关系的四种情况第一种情况是菌体 的比生长速率（卩）和产物的比生产速率（Qp）都有一个相似的并且较宽的最适pH范围；第 二种是Qp（或卩）的最适pH范围很窄，而□（或Qp）的范围较宽；第三种是卩和Qp有相 同的最适pH范围，但范围很窄，即对pH值的变化敏感；第四种，卩和Qp都有各自的 最适pH范围。

属于第一种情况的发酵过程比较易于控制，第二、三模式的发酵pH须 要严格控制，最后一种情况应该分别严格控制各自的最适pH选择最适pH的原则是既有利于菌体的生长繁殖，又可以最大限度地获得高的产量 一般最适pH是根据实验结果来确定的，通常将发酵培养基调节成不同的起始pH值， 在发酵过程中定时测定、并不断调节pH，以维持其起始pH值，或者利用缓冲剂来维持 发酵液的pH同时观察菌体的生长情况，菌体生长达到最大值的pH即为菌体生长的最 适pH产物形成的最适pH也可以如此测得只有在最适pH下菌种才能生长才能达到 最大菌种产量3 •溶解氧的影响溶氧是需氧发酵控制最重要的参数之一由于氧在水中的溶解度很小，在发酵液 中的溶解度亦如此，因此，需要不断通风和搅拌，才能满足不同发酵过程对氧的需求 溶氧的大小对菌体生长和产物的形成及产量都会产生不同的影响如谷氨酸发酵，供氧 不足时，谷氨酸积累就会明显降低，产生大量乳酸和琥珀酸需氧发酵并不是溶氧愈大愈好溶氧高虽然有利于菌体生长和产物合成，但溶氧 太大有时反而抑制产物的形成因为，为避免发酵处于限氧条件下，需要考查每一种发 酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度，并使发酵过程保持在最适浓度。

最适溶氧浓度的大 小与菌体和产物合成代谢的特性有关，这是由实验来确定的.4.5总工艺流程列叙工艺流程：培养嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌-对数期接种-将菌种放在MRS培 养基培养f接种在三个烧瓶里中f改变营养因子条件f改变理化控制条件-37° C下 培养72小时f无菌室中接种f分装试管中f分别滴加含嗜热链球菌的牛乳ImLf编号 密封f测定菌种含量f比较方差分析f得到最产量最大的培养基配方与理化条件5-预期结果结果表明优化后的培养基利用的营养因子为：玉米浆3%、牛肉膏1%、乳糖 1%原MRS培养基的营养因子配比为：蛋白陈1%，牛肉膏1%，乳糖1%，葡 萄糖1%，番茄汁1%，其中际蛋白陈价格昂贵(零售价格约10元/kg)，而 优化后培养基的主要营养因子为玉米浆其为生产玉米蛋白的副产品，价格低廉(价格约 5 — 6元/kg)，进行酸处理后成本也不过7 — 8元/kg因此，优化后的MRS培 养基成本降低约4%，大大降低了成本研究结果表明，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、 保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌，在优化后的MRS培养基发酵液中，3 7^培养20h， 菌落数均高于原MRS培养基发酵液的菌落数，达到1护cumL以上，乳酸菌发酵 液得到了浓缩，大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本，原料成本降低了约4 0%，同时 使菌种数量达到最大。

6方案实施时可能出现的问题与对策(1) 配料的R值因子，是影响乳酸菌生长浓度的主要因素2) 微生物的生长pH值范围极广，从pHv2〜＞8都有微生物能生长但是绝大多数 种类都生活在pH5.0〜9.0之间7、设计感受7.1.关于本方案通过正交试验优化了乳酸菌发酵培养基，用价格低廉的原料（如玉米浆等）代替了价 格昂贵的原料（如际蛋白陈）,用其发酵嗜酸乳杆菌，嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌等，发酵液 中菌落数均高于原MRS培养基发酵液的菌落数，达到109.fu/mL以上,取得了较好的效果, 大大降低了乳酸菌的发酵成本,对乳酸菌保健食品的开发具有实际意义7.2.关于自我这是大学阶段我第一次深入地对工厂加工工序进行设计，刚开始还感觉无从下 手，可在我们小组的讨论分工下，慢慢就有了思路，团结的力量就是很伟大，这无形中 培养了我们的团队观念和合作意识通过自己筛选课题然后查资料解决问题，感觉对我 动手解决问题能力的提高很有帮助不过我发现自己知识真是太少了，生物专业知识不 踏实，我必须努力学习，不然毕业后进工厂只能做力气活同时我明白了科学实验必须 有严谨的作风，端正的态度，扎实的专业知识和充分的准备，所以现在大学生的我们要 努力用知识武装头脑，为不久的将来投入社会打下坚实的基础。

总而言之，通过本次的 课程设计使我获益匪浅，学到了很多书本上学不到的知识，更重要的是使我的语言表达 能力得到很大程度提升最后再一次诚挚的感谢所有在设计中帮助过我的良师益友和亲爱的同学们8参考文献【1】 徐中儒•农业试验最优回归设计.北京:农业出版社,1988【2】 贵州农学院.生物统计附试验设计.北京:农业出版社,1983【3】 刘忠敏，林兴兵，杨生玉.现代应用生物技术.北京：化学工业出版社，2004【4】 陶兴元，刘志国，田俊.生物工程概论.北京：化学工业出版社，2005【5】 诸葛健，沈微.工业微生物育种.北京：化学工业出版社，2006【6】 鲍新华.生物工程.北京：化学工业出版社，2008指导教师评语:课程设计报告成绩： ，占总成绩比例： 课程设计其它环节成绩：环节名称： ，成绩： ，占总成绩比例： 环节名称： ，成绩： ，占总成绩比例： 环节名称： ，成绩： ，占总成绩比例： 总成绩： 指导教师签字：年 月 日本次课程设计负责人意见：负责人签字：年 月 日。