液相色谱方法开发new0603ppt课件

液相色谱的应用以及方法开发提提 纲：纲：v 据2008年统计，世界上化合物总数多达5000多万种v 在全部有机化合物中仅有20左右的样品适用于GC分析v 而HPLC可对80左右的有机化合物进行分离和分析v HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备v 在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用潜力v 在食品研究中的分析应用碳水化合物类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂颜料和染料（色素维生素霉菌（黄曲霉毒素农药残留和兽药残留多环芳烃（PAHS和亚硝酸v v 在生物化学和生物工程中的应用 在无机离子分析中应用在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析 二二.方法开发的过程方法开发的过程Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2第一步干什么第一步干什么?t想办法得到各种信息分析时要了解哪方面的情况？分析时要了解哪方面的情况？t灵敏度的要求有多高? t样品的本底是否很复杂? t有多少组份要分析? t对分析的精确度、准确度等有多高要求? t是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离分离(制备制备)时要了解哪方面的情况？时要了解哪方面的情况？t要分离（即制备）的样品量有多大? t要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? t是否需要保持生物活性? t对分离产物纯度的要求有多高? t纯度或活性的鉴定如何完成?使用文献方法注意点使用文献方法注意点t色谱柱填料的种类、品牌是否相同?t注意文献方法的流动相1）选择）选择HPLC检测器检测器t对样品有响应并有一个输出信号t应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系t由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象t并不是所有的检测器是线性的t受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距2）方法开发一般的具体步骤）方法开发一般的具体步骤t先用一根短的色谱柱t用相对较高的流速t使用尽可能纯度高的标准品t先用高强度的洗脱液t调节值改变保留值t调节a值改变选择性 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 加入“对离子”，使样品呈中性请记住请记住 每次改变一个参数 每次改变一个参数反相色谱的方法开发反相色谱的方法开发t 开发过程实例 色谱柱：C18，4.6mm15mm 流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度） 举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：1ml/min方法开发的其他因素方法开发的其他因素t流速对柱效的影响 3）液相色谱的方法开发 梯度洗脱法梯度洗脱法液相色谱泵液相色谱泵t稳定平滑并且重现性好的流速t可靠且充分的溶剂混合梯度的洗脱方式梯度的洗脱方式t高压梯度及低压梯度溶剂 A溶剂 B泵 A泵 B混合器A 高压梯度溶剂 A泵溶剂 B比例阀（溶剂混合点）混合器B 低压梯度（溶剂混合点）梯度：高压混合梯度：高压混合t高压梯度梯度：低压混合梯度：低压混合t低压梯度死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意注意 滞后体积包括进样器、阻尼滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度阻尼器混合器梯度滞后大小的影响梯度滞后大小的影响t滞后体积太大会引起梯度变化的延迟实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受滞后体积变化的影响滞后体积变化的影响t设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化t滞后体积随反压变化的后果：梯度百分比保留时间梯度曲线好的梯度滞后曲线保留时间梯度百分比不好的梯度滞后曲线固定滞后体积，改善了梯度性能普通的低压梯度系统色谱柱反压变化对梯度实验的影响色谱柱反压变化对梯度实验的影响without pulse damperBack-pressure:60 bar, 85 bar and 105 barVariation: 2%Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L each梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点t优点一般流出问题一般流出问题早流出峰的分离度差.迟流出峰的峰宽增加而峰高降低.由于k范围宽，所以分析时间长.强保留组分造成柱污染.等梯度洗脱等梯度洗脱 - 在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变.梯度洗脱梯度洗脱 - 一个解决方案一个解决方案优点优点 改善分离度 提高检测性能 能够分离复杂样品 缩短分析时间 降低由于强保留组分而使色谱 柱性能变差的可能性其他应用其他应用 柱清洗 方法开发中的尝试运行 梯度洗脱梯度洗脱 - 在分离过程中改变流动相组成.梯度平衡时间的影响（一）梯度平衡时间的影响（一）10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复梯度平衡时间的影响（二）梯度平衡时间的影响（二）平衡时间6分钟平衡时间7分钟平衡时间8分钟平衡时间9分钟 平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。

高效液相经常使用粒径5um 的色谱柱，用过一段时间后，柱压会略有升高，尤其是做中药常用来洗色谱柱的溶剂为甲醇，当色谱柱用甲醇洗过之后，再用含乙腈的流动相平衡，会使柱压迅速升高，色谱柱渗漏，这是由于甲醇和乙腈汇合产生局部高压因此，这种情况下，应慢慢升高流速，可以从0.6ml/min开始，一步步的平稳柱压，防止色谱柱漏液 梯度洗脱装置分两种：梯度洗脱装置分两种：高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂分别输入，高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂分别输入，低压梯度：在常压下将两种或多种溶剂先混合，然后用高压低压梯度：在常压下将两种或多种溶剂先混合，然后用高压 泵将流动相输入到色谱柱中泵将流动相输入到色谱柱中梯度洗脱优点：梯度洗脱优点：提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度在使用梯度洗脱时需要注意的地方：在使用梯度洗脱时需要注意的地方：1.1.注意各溶剂间的互溶性；注意各溶剂间的互溶性；2.2.对溶剂的纯度要求更高（影响重现性）；对溶剂的纯度要求更高（影响重现性）；3.3.注意梯度变化导致系统压力的变化，防止超出限度注意梯度变化导致系统压力的变化，防止超出限度。

混合溶剂的粘度常随组成的变化而变化在梯度洗脱时，常会出现压混合溶剂的粘度常随组成的变化而变化在梯度洗脱时，常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是，当二者以相近的比例混合力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是，当二者以相近的比例混合时，粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍因此要时，粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍因此要防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力4.4.低压梯度混合后易产生气泡，要注意脱气一般低压梯度是低压梯度混合后易产生气泡，要注意脱气一般低压梯度是需要在线脱气机来完成的，因各流路溶剂混合后会产生很多气需要在线脱气机来完成的，因各流路溶剂混合后会产生很多气泡；而高压梯度可不用脱气机脱气泡；而高压梯度可不用脱气机脱气5. 5. 梯度操作容易出现鬼峰，应作空白试验空白对照至少做三梯度操作容易出现鬼峰，应作空白试验空白对照至少做三次6.6.选择梯度操作时，几相之间相变化要尽量小选择梯度操作时，几相之间相变化要尽量小, ,否则不易平衡否则不易平衡7.7.梯度洗脱应选用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（梯度洗脱应选用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）。

变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）8.要注意水相中盐的浓度，防止在有机相提升过程中盐的析出要注意水相中盐的浓度，防止在有机相提升过程中盐的析出特别要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱特别要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相的流动相 有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶例如：乙腈和溶例如：乙腈和1mol/L1mol/L的醋酸铵（的醋酸铵（pH5.16pH5.16）做梯度洗脱，乙）做梯度洗脱，乙腈含量超过腈含量超过70%70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于于30%30%时就会分层等当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出时就会分层等当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心9.9.每次梯度洗脱后必须对色谱柱进行再生处理，将柱子平衡到每次梯度洗脱后必须对色谱柱进行再生处理，将柱子平衡到初始状态梯度结束后用初始流动相冲洗，可用初始状态梯度结束后用初始流动相冲洗，可用10103030倍柱容倍柱容积的初始流动相洗脱色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全积的初始流动相洗脱色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡！柱子再生。

梯度周期）平衡！柱子再生梯度周期）9.9.要检测的峰尽量在有机相和水相的比例稳定时出峰，这要检测的峰尽量在有机相和水相的比例稳定时出峰，这样出峰时间的重现性较好；样出峰时间的重现性较好；10.10.有机相的比例不是越高越好，只要样品峰能满足要求有机相的比例不是越高越好，只要样品峰能满足要求即可，有机相比例相差越大，梯度要平衡的时间越长即可，有机相比例相差越大，梯度要平衡的时间越长 ；11.11.低压混合，流速慢，做质谱时，尽量不要跑梯度，平衡低压混合，流速慢，做质谱时，尽量不要跑梯度，平衡时间比较长（除非你要测多个成分，比如中药指纹图谱），时间比较长（除非你要测多个成分，比如中药指纹图谱），如果非要跑，一定要尽量减小死体积如果非要跑，一定要尽量减小死体积12.12.梯度淋洗和气相色谱中的程序升温相似，给色谱分离带来梯度淋洗和气相色谱中的程序升温相似，给色谱分离带来很大的方便，它对于复杂混合物，特别是保留强度差异很大的很大的方便，它对于复杂混合物，特别是保留强度差异很大的混合物的分离，是重要的手段但离子色谱电导检测器是一种混合物的分离，是重要的手段但离子色谱电导检测器是一种总体性质的检测器，因此梯度淋洗一般只在含氢氧根离子的淋总体性质的检测器，因此梯度淋洗一般只在含氢氧根离子的淋洗液中采用抑制电导检测时才能实现。

洗液中采用抑制电导检测时才能实现13.13.初始平衡时间尽量长点初始平衡时间尽量长点, ,第一针最好不要第一针最好不要, ,每走完一针后的每走完一针后的平衡时间尽量一致平衡时间尽量一致 (很重要很重要) )14.14.注意柱子的耐水性如何注意柱子的耐水性如何, ,如果水相过高如果水相过高, ,很难做到重现很难做到重现18.18.注意测量的波长注意测量的波长, ,如果接近截止波长如果接近截止波长, ,请选用梯度级试剂请选用梯度级试剂改变流速改变流速02468101214Time (min)5%/min1 ml/min- 5%/ml5%/min2.5 ml/min- 2%/mlSolvents must be pure or ghost peaks will occur.Make certain the buffer is soluble at final gradient mobile phase composition.Allow time for column reconditioning between runs.Ghost Peaks0% MeOH100% 梯度洗脱的实际考虑梯度洗脱的实际考虑对于下列应用，梯度洗脱可能不适合对于下列应用，梯度洗脱可能不适合: 使用强保留添加剂的应用. 离子对色谱应用 在裸硅胶柱上的正相HPLCBlank run producing ghost peaks due toimpure water.结论结论t充分用已知样品结构确定以哪种方法开始开发液相色谱方法的考虑因素开发液相色谱方法的考虑因素t分离度是色谱分离中主要考虑的因素t除分离度之外，在开发色谱方法时，以下几个因素也都要考虑：。