疾病治疗的新方法.ppt
疾病治疗的新方法中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室邱 广 蓉 2、基于细胞的治疗有望改变移植潜力 胚胎干细胞（ES细胞） 有能力控制和引导分化 有可能用于组织工程和组织修复 基因治疗：将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿 因基因缺陷和异常引起的疾病，达到治疗的 目的基因治疗的关键在于：基因转移 靶细胞 基因表达 基 因 治 疗 策 略基因修正（直接疗法） 定点导入外源正常基因，代替有缺陷的基因，而对 靶细胞基因组无任何改变基因添加（间接疗法） 非定点导入外源正常基因，而没有去除或修复有缺 陷的基因 基 因 治 疗 策 略靶向抑制基因表达 应用反义核酸技术，使基因表达抑制（如抑癌基因、自身免疫病的免疫应答等）靶向杀伤特异细胞 导入细胞毒素基因、药物前体、细胞因子等，杀伤特异细胞，适用于肿瘤治疗 反义核酸技术介导的肿瘤基因治疗 基 因 治 疗 的 基 本 步 骤正常基因的克隆与分离目 的 基 因 的 转 移靶 细 胞 的 选 择外源基因在靶细胞中有效表达从基因组中获得物 理 方 法化 学 方 法膜 融 合 法受 体 介 导病 毒 介 导外周血T淋巴细胞启 动 子增 强 子定 点 整 合 基 因 治 疗 途 径根据基因转移的受体细胞的不同，分为：（1）生殖细胞基因治疗 理想的治疗途径（2）体细胞基因治疗 常用的治疗途径 生 殖 细 胞 基 因 治 疗将正常基因转移至患者的生殖细胞，使其发育成正常的个体。
是理想的治疗方法，从根本上杜绝遗传病在人群中的传播存在问题：（1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展（2）基因转移效率不高，只能应用显微注射方法（3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，不适用于人类 体 细 胞 基 因 治 疗将正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后回输体内可以定点整合，也可随机整合存在问题： （1）对特定基因座的基因转移，目前尚存在困难 （2）随机的插入可能引起后代的基因突变 基 因 转 移 方 法物理方法 电穿孔法 借助脉冲电流击穿靶细胞膜，使其通透性增加微粒子轰击法 利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，将外源基因包裹形成微粒，应用可调电压产生的轰击波使其获得高速度（基因枪技术），瞬间进入靶细胞 基 因 转 移 方 法物理方法 基 因 转 移 方 法化学方法磷酸钙沉淀法 基 因 转 移 方 法化学方法磷酸钙沉淀法 基 因 转 移 方 法膜融合法脂质体法 基 因 转 移 方 法DNA脂质体仙苔病毒PEG 基 因 转 移 方 法受体介导基因转移 将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，可通过细胞内吞途径达到转移基因的目的 目的基因与去唾液酸糖蛋白耦连，使肝细胞能特异性吸收，并在肝细胞中表达。
基 因 转 移 方 法同源重组法 基 因 转 移 方 法病毒介导的基因转移是最有效的转移目的基因的方法 感染细胞 逆转录病毒载体单链RNA病毒常用病毒载体 腺病毒载体双链DNA病毒 逆 转 录 病 毒 载 体逆转录病毒的组成：单链RNA和蛋白质 RNA 双链DNA 原病毒 RNA病毒蛋白逆转录酶整合到宿主细胞转录翻 译病毒颗粒 逆 转 录 病 毒 载 体 逆 转 录 病 毒 载 体小鼠白血病病毒（Mo-MLV）改建的逆转录病毒载体保留LTR和包装信号 逆 转 录 病 毒 载 体（1）优点： 逆 转 录 病 毒 载 体缺点： 腺 病 毒 载 体优点： 腺 病 毒 载 体缺点： 受体（靶）细胞的选择原则： 受体（靶）细胞的选择常用细胞：外周血T淋巴细胞皮肤成纤维细胞造血干细胞 地中海贫血、严重联合免疫缺陷病肝细胞 家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病比较常用 人类的基因治疗（1）单基因遗传病 12%，多采用基因添加策略（2）肿瘤 63%，多采用靶向杀伤特异细胞、靶向抑制基因表达、基因添加等策略（3）感染性疾病（6%）（4）血管疾病（8%） 单基因遗传病的基因治疗ADA（腺苷酸脱氨酶）缺乏症属于AR遗传病由于腺苷酸脱氨酶缺乏，导致脱氨腺苷酸增多，改变了甲基化能力，产生毒性效应，使T淋巴细胞受损，引起反复感染等症状。
传统的治疗方法：骨髓移植 ADA的基因治疗ADA基因逆转录病毒载体重组分子LTR ADA SV neo LTR患者T淋巴细胞抗CD3单克隆抗体IL-2刺激细胞分裂导入基因表达10天回输患者体内每隔12个月治疗1次治疗10次患者体内ADA水平达正常25% 遗传病的基因治疗乙型血友病属于XR遗传病形成原因：凝血因子缺乏临床表现： 易于出血、凝血时间长、在轻伤或小手术后常出血不止基因定位：Xq26.327.2 乙型血友病的基因治疗因子基因逆转录病毒载体重组分子LTR F neo SV PBO LTR导入仓鼠细胞F表达患者皮肤成纤维细胞F表达患者皮肤成纤维细胞（体外培养）F表达F表达水平达正常人5% 回输患者体内 肿瘤的基因治疗肿瘤基因治疗策略： 1 细胞因子导入 2 自杀基因导入 3 反义核酸技术 4 抑癌基因导入 细胞因子介导的肿瘤基因治疗IL-2（白细胞介素-2）TNF（肿瘤坏死因子）逆转录病毒载体导入肿瘤浸润淋巴细胞（体外培养的自体细胞）从肿瘤组织中分离特异性进入自体肿瘤部位在自体肿瘤部位持续存在无副作用回输患者体内进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤作用 自杀基因介导的肿瘤基因治疗 药物前体 （无毒）基因 酶 药物复合物 （有毒） 细胞死亡 常用自杀基因胸苷激酶（TK）基因单纯疱疹病毒TK基因： 催化脱氧胸苷（TdR）磷酸化为脱氧胸苷酸 催化胸苷类似物GCV磷酸化哺乳动物TK基因： 催化脱氧胸苷（TdR）磷酸化为脱氧胸苷酸GCV对细胞毒性很低，但磷酸化后明显抑制细胞DNA合成 甲胎蛋白（AFP）调控序列HSV-TK重组载体（只在肿瘤细胞中表达）导入肿瘤细胞GCV-p（有毒）加入GCV（胸苷类似物）抑制DNA合成肿瘤细胞死亡邻近细胞死亡或凋亡 ）正常细胞加入GCVGCV无法磷酸化（无毒） 有毒产物通过细胞间隙扩散免疫系统介导GCV激活后释放可溶性因子肿瘤出血坏死血管内皮细胞表面粘附蛋白促进淋巴细胞粘附肿瘤组织内细胞因子激活淋巴细胞细胞凋亡 抑癌基因介导的肿瘤基因治疗野生型抑癌基因失活与肿瘤发生密切相关将正常野生型抑癌基因导入肿瘤细胞，代替和补偿有缺陷的抑癌基因，抑制肿瘤的生长或逆转表型基因添加代表性抑癌基因：p53 抑癌基因介导的肿瘤基因治疗大鼠金属硫蛋白启动子野生型p53基因重组表达载体癌细胞株EB细胞转染加入100mol/LCaCl2诱导4小时细胞凋亡、裸鼠体 内致瘤能力丧失 基因治疗存在的问题1 导入基因的持续表达问题 外周血淋巴细胞和皮肤成纤维细胞有寿命限制，需不断回输含目的基因的细胞。
可采用寿命较长的靶细胞如造血干细胞或骨髓前体细胞2 导入基因的高效表达问题 将高效启动子（如人巨细胞病毒启动子）构建入逆转录病毒载体3 安全性问题 防止辅助病毒污染和载体病毒之间重组时间发生。
