血红蛋白的提取和分离

一）蛋白质提取和分离的原理：（一）蛋白质提取和分离的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类类的蛋白质的蛋白质一、基础知识一、基础知识凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示1、凝胶色谱法的定义2、凝胶的成分是什么？3、凝胶色谱法的原理（二）（二）凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大的大 小，利用具有小，利用具有网状结构网状结构的凝胶的的凝胶的分子筛分子筛作用，来进行作用，来进行分离1.概念：3.凝胶色谱法的原理分子筛效应：当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢移动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

速度较快相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：蛋白质分子量的大小蛋白质分子量的大小蛋白质分子量的大小蛋白质分子量的大小三）缓冲溶液（三）缓冲溶液 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变基本不变1.1.作用作用:2 2 2 2.在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是:其目的是其目的是其目的是其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色红色红色红色)和科学研究和科学研究(活性活性活性活性)缓冲溶液的缓冲作用体现在哪里？磷酸缓冲液磷酸缓冲液,（四）（四）电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这下，这些基团会带上正电或负电。

些基团会带上正电或负电在电场的作用下，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动电泳利用了待分离样品中各种分子带电性电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离各种分子的分离3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳凝胶电泳2 2）提问：）提问：）提问：）提问：血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？二、实验操作二、实验操作（一）选择实验材料（1 1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？哪种血液来提取血红蛋白？为什么？哺乳动物血液因为该细胞中没有细胞核，血哺乳动物血液因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高红蛋白含量高血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分固体物质：固体物质：固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。

红色血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A A、固定：、固定：将色谱柱将色谱柱装置固定在支架上装置固定在支架上B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀填装均匀注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙凝胶颗粒之间的空隙2 2、装填凝胶柱时不得有气泡、装填凝胶柱时不得有气泡存在：存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果降低分离效果二）实验操作过程1、凝胶色谱柱的装填2 2、蛋白质提取和分离步骤、蛋白质提取和分离步骤样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定a.a.样品处理及粗分离样品处理及粗分离(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤:血液血液柠柠檬檬酸钠酸钠低速短时离心低速短时离心吸出上层血浆吸出上层血浆红细胞红细胞5 5倍体积生理盐水倍体积生理盐水 缓慢搅拌缓慢搅拌10min10min低低速短时离心速短时离心吸出上清液吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄反复洗涤直至上清液无黄色色。

洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：采集的血样为什么要加入柠檬酸钠？防止血液凝固为什么要低速、短时离心？速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果同沉淀，达不到分离的效果搅拌的时候为什么强调“缓慢”？防止红细胞破裂释放出血红蛋白洗涤目的？洗涤目的？洗涤目的？洗涤目的？去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少化，洗涤次数不可过少2 2 2 2）血红蛋白的释放：）血红蛋白的释放：）血红蛋白的释放：）血红蛋白的释放：加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加，再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置于置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分钟（分钟（加速细胞破裂加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白细胞破裂释放出血红蛋白思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等怎样除去这些杂质呢？(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：离心后溶液分为4层，从上到下分别是何种物质？各有什么样的表观特征白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体红色透明液体红色透明液体红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层杂质沉淀层杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色暗红色暗红色暗红色）甲苯层甲苯层甲苯层甲苯层（无色透明无色透明无色透明无色透明）分离：分离：分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体红色透明液体。

血血红红蛋蛋白白的的取取和和分分离离原原理理分离过分离过程程组组成成作作用用粗粗 分分 离离纯纯化化血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和离离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性原原理理分离过分离过程程凝胶色谱法凝胶色谱法原原理理分离过分离过程程组组成成作作用用缓冲溶液缓冲溶液组组成成作作用用粗粗 分分 离离纯纯化化蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯化化纯度鉴定纯度鉴定。