峰形拖尾的原因及解决方法
技术报告改善反相HPLC中的峰拖尾在反相HPLC中峰拖尾是一个普遍的现象特别是分离碱性化合物和通过 HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾缘由峰拖尾可以引起分离度降低，灵敏 度减弱，精密度和定量变差图1表明峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相 关图2表明准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影 响图1拖尾对分离度和灵敏度的影响当峰拖尾（T，拖尾因子）从1.0增加到2.0时，分离度（Rs）从1.5降到 1.0灵敏度（峰高）由于峰的体积增大和样品的浓度降低而降低图2峰拖尾对准确度和精密度的不利影响拖尾峰使数据系统难以准确确定峰的终点，故而影响准确度和精密度在这 个例子中，在B点测得到峰面积比在A点测得的峰面积少约3%峰拖尾的原因，峰拖尾的主要原因有：1、 溶解样品的溶剂比流动像更强，2、 样品量过载，3、 固定相中的硅醇基与胺类物质相结合反应，4、 硅胶吸附酸性化合物，5、 色谱柱柱床中有空隙只要确定了拖尾的原因就可以采取措施减少拖尾并消除之表1）表1峰拖尾：原因及解决方案原因解决方案样品溶剂极性强于流动相在流动相中溶解样品，尽可能降低样品溶剂的强度样品量过载减少进样量，参考表2中推荐的不同柱 型对应的不同进样体积硅醇基与胺类物质的结合1. 调节流动相的pH<3.0。
2. 增加流动相的离子强度， 25mM〜50mM3. 流动相中增加竞争性的胺类，10mM的TEA （三乙胺）4. 选择低硅醇活性的固定相参照图6C18柱按固定相硅醇活性分级5.酸性物质在硅胶上的吸附1. 增加流动相中盐的浓度，25mM〜50mM2. 调节流动相的pH<3.03. 增加竞争性的有机酸，1%醋酸或者是0.1%TFA （三氟乙酸）柱子空隙更换新的色谱柱尝试填充空隙很少能达到较好的效果由于溶解样品的溶剂极性强于流动相而引起的拖尾如果溶解样品的溶剂极性强于流动相，就会引起宽的甚至是拖尾的峰有几 种线索可以帮助确定是由于此种原因引起的拖尾第一种就是先流出的峰的拖尾 较后流出的峰拖尾严重；另一种迹象就是进样量减少或者是样品经流动相稀释后 进样峰拖尾减轻了如果怀疑拖尾的原因是流动相的强度引起的，解决很简单将样品溶解在流 动相中，或者将样品经流动相稀释至进样后峰拖尾符合要求二、由样品量过载引起的峰拖尾当进样量超过柱子的容量，样品峰会呈现一个直角三角形当更多的样品量 注入时，峰的前端变得很尖而后端就拖尾更严重另一个现象就是色谱柱过载后 保留时间会随样品量的增加而提前见图3）由样品过载引起的峰拖尾的解决 方案就是减少进样量。
表2提供了各色谱柱的直径及参考的最大进样量，表2 还提供了进样量的范围，因为实际进样量依赖于柱子的填料（具有高的表面积的 填充材料可以具有大的进样量），分析物质（分子量大的进样量要少），和其他的 因素比如样品在流动相中的溶解性图3样品量过载引起的拖尾样品过载，峰的前端会变得尖锐，后端拖尾，保留时间会稍微提前如果峰形看上去有点像直角三角形，那么可能就是过载了表2 HPLC色谱柱的参考最大进样量柱直径（mm）ID参考最大样品量（mg）1035-654.64.5-9.03.02.0-4.0表3反相HPLC常用缓冲液缓冲液pKa缓冲液范围UV截止波长（nm）磷酸盐2.11.1 〜3.12007.26.2 〜8.212.311.3 〜13.3醋酸盐4.83.8 〜5.8210柠檬酸盐3.12.1 〜4.12304.73.7 〜5.75.44.4 〜6.4Tris （三羟甲基氨基甲烷）8.37.3 〜9.3205三乙胺11.010.0 〜12.0200三、由固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾在反相HPLC中出现拖尾的另一个常见的原因是由于带正电荷的溶液（胺 类）与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换而引起的二次保留（图4）， 具有显著的硅醇活性的固定相的色谱柱大部分都会发生此现象，而且中性 pH（6〜8）条件下比在酸性pH （<3）更易发生。
酸性和中性的化合物一般不受影响，一些碱性化合物更易受到此效应的影 响如果是因为硅醇的原因引起的拖尾，可以从下面几部来纠正拖尾的问题首 先，确认流动相中有合适的缓冲盐，可能的话尽量在pH<3的条件下操作使用 足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应在pH<3的条件下操作，可使硅胶固定相上的硅醇基质子化，减少了溶质与 硅醇反应的几率图4相互作用引起的峰拖尾X 二 Basic Compound固定相表面的酸性硅醇基可以形成与碱性化合物反应的离子交换位点，经反 相HPLC分离胺类化合物时，这种离子交换反应常常引起峰的保留（二次保留） 和峰拖尾另一种解决拖尾的方法是在流动相中加入竞争性的胺类，加到流动相中的三 乙胺（TEA）就是这个目的TEA可以与硅醇发生强的反应，并抑制样品中的 胺类与硅醇反应图5是TEA如何提高峰形的例子，多数情况下，大约10mM 的TEA足够了有些色谱分析者反对向流动相中加入竞争性的胺类，因为增加了分析方法的复杂性并且用一种不易逆转的方法改变了色谱柱的性质强度胺类，像三乙胺， 不易从色谱柱上洗脱下来那意味着用过含有TEA的色谱柱就不再适合应用于 流动相中不含TEA的分析图5向流动相中加入TEA用来提高峰形Nc TEA 1 IOitMTEA3O.Q 2J5 5.0 0-0 2-5 S.CTime (min) Tig Jmin}色谱柱：Eclipse XDB-C8 4.6*150mm流动相：85%25mMNa2HPO4，pH7.0，15%ACN流速：1.0ml/min温度：35 °C样品：苯丙胺类1. 苯丙醇胺2. 麻黄碱3. 苯丙胺4. 甲基苯丙胺5. 苯三胺向流动相中加入竞争性的胺类，三乙胺等，可以减少峰拖尾。
三乙胺与 硅醇强烈作用，减少了样品混合物中胺类与硅醇的作用阿米替林常用来检 测反相HPLC色谱柱的硅醇活性下表根据阿米替林的对称性(峰拖尾)对 色谱柱进行了分类其中阿米替林具有较低的对称性的柱子具有较低的硅醇 活性，这些色谱柱是常常用来用反相HPLC分离胺类物质的最好选择数据 来源于国家标准化研究所对标准参考物质的分析认证870 “液相色谱用柱性 能测试混合物”使用三乙胺可以不用选择低硅醇活性的固定相图6根据硅醇的活性分 列出了常用的C18反相色谱柱，在图6中的分类根据测定阿米替林的对称性， 一种胺类常用来测定固定相的硅醇活性阿米替林在固定相中具有较低拖尾 （低对称值）时，该固定相就显示较低的硅醇活性并且检测碱性化合物时就 会有较低的拖尾图6根据硅醇活性排列的常用C18柱Aca C1SXterra RF"-18In&rt&ii ODS3LunaKrcmasil 018HyPURa 1 V O1SSphcnsorta ODS1In&rtsii ODS?Symmo-try Ci81,25 1.5 1_75色谱柱：4.6 X 150mm，5um流动相：80%甲醇20%0.05M磷酸盐缓冲液pH7流速：2.0ml/min温度：24 °C样品：阿米替林四、酸性化合物在硅胶上吸附引起的拖尾虽然较胺类引起的拖尾少，酸类物质有时候引起峰的展宽和拖尾主要由 于硅胶固定相的吸附。
纠正因为此类原因引起的拖尾就应提高流动相中盐的 浓度来抑制二次反应，降低流动相的pH使硅醇和溶质质子化，必要时可以 向流动相中加入竞争性的酸（图7）图7酸性化合物引起的峰拖尾通常可以向流动相中加入酸来改善曰 m fo re Add log ATturr Ajcd
