凉茶药材鸡蛋花及其混伪品的DNA条形码鉴定

［摘要］该研究应用ITS2序列作为DNA条形码鉴定凉 茶药材鸡蛋花及其混伪品，共收集 48份药材和基原植物样 本，提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向 测序，经 CodonCode Aligner 拼接注释获得序列，然后应用 MEGA5.0 比对 ITS2 序列，计算种内和种间遗传距离，构建 系统进化NJ树进行鉴定结果表明，鸡蛋花ITS2序列长度 为244 bp，种内遗传距离为0〜0.016 6,远小于其与混伪物 种间的遗传距离0.320 8〜0.650 4, NJ树结果显示鸡蛋花与 其混伪品均可准确区分因此，应用ITS2条形码能够准确、 有效地鉴别凉茶药材鸡蛋花及其混伪品，为鸡蛋花药材的鉴 定提供了一种新的分子手段，为其使用安全提供了有力保 障［关键词］DNA条形码；ITS2；鸡蛋花；混伪品鸡蛋花为夹竹桃科植物鸡蛋花 Plumeria rubra Linnaeus 的干燥花，别名缅栀子、蛋黄花和擂捶花［1］鸡蛋花始载于 《植物名实图鉴》群芳类，原产自南美洲，主要在我国广东、 广西、福建和云南等地栽培据《岭南采药录》记载，鸡蛋 花“治湿热下痢，里急后重，又能润肺解毒”［2］，因此被作 为凉茶的主要成分药材，广泛用于“王老吉”和“五花茶”等凉茶饮品中。

此外，鸡蛋花还可用于炒食、煲汤［3］、提炼 天然香料和化妆品成分，其树皮也可入药［4］，具有很好的药 用、食用和经济价值目前，鸡蛋花的研究主要集中在其化 学成分［5-6］及挥发油［7-9］分析上，鉴别研究也仅局限于其物 种本身的显微鉴定和薄层分析［10］，对其混伪品及鉴定均鲜 有研究本研究通过市场调查发现，鸡蛋花与木棉科的木棉 Gossampinus malabarica (Candolle) Merrill (目前《中国 植物志》英文版中木棉拉丁名已变更为 Bombax ceibaLinnaeus)、紫葳科的凌霄 Campsis grandiflora (Thunberg) Schumann、美洲凌霄 C. radicans (Linnaeus) Seem 和硬骨 凌霄 Tecomaria capensis (Thunberg) Spach 以及豆科的鸡 冠刺桐 Erythrina crista-galli Linnaeus 的花朵花型相似，易混 淆混用［11］，尤其是褐化的干燥花或是当花型皱缩，形态不 完整时，通过形态鉴定更不易鉴别，而理化分析鉴定不仅需 要样品量多且结果不稳定，因此急需寻求一种快捷且准确的 新方法来鉴定凉茶药材鸡蛋花及其混伪品，为其使用安全提 供保障。

DNA条形码(DNA barcoding)技术是近年来在物种鉴 定领域发展的一种新方法2003 年，加拿大科学家 Hebert 等首次提出了 DNA 条形码的概念［12］，它是指利用短的、标 准的 DNA 序列来鉴定物种的新技术［12-13］目前，线粒体 COI 基因序列［12］已作为通用条形码广泛应用于动物物种鉴 定，而在植物领域，科学家分别筛选了 psbA-trnH和ITS[13], rbcL[14], matK[15], trnL[16], psbK-psbI[17]等分子标记以 及不同序列组合，但由于自然界植物种群的复杂性，仍没有 找到一种适用于所有类群的“完美DNA条形码” 2010年， 陈士林等首次提出将ITS2作为药用植物标准DNA条形码 [18]，并建立了以 ITS2（internal transcribed spacer 2）为核心、 psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系[19-22]， 为中药材的鉴定奠定了坚实的分子理论基础，提供了有效准 确地鉴定中药材的新方法[23]1 材料本研究实验材料共48份（表1）鸡蛋花样本20份，包 括药材14份，基原植物 6份，来自广东广州、广西南宁及 四大药材市场和药店。

混伪品包括5 个物种 28份样本，其 中木棉花10份（药材8份，原植物2份），其他混伪品均为 原植物样本，凌霄花8份，美洲凌霄花7 份，鸡冠刺桐2份， 硬骨凌霄 1 份，分别来自广东中国科学院华南植物园、云南 中国科学院西双版纳热带植物园、江西庐山、湖北武汉、重 庆等地实验材料经中国医学科学院药用植物研究所林余霖 副研究员和中国科学院华南植物所童毅华博士鉴定，凭证样 本保存于中国中医科学院中药研究所本研究所用 ITS2 序 列共50条，其中48条为实验所得，序列均提交至GenBank， 登录号参见表1， 2条序列由GenBank下载而来，分别为鸡 冠刺桐 FN825780 和硬骨凌霄 AY6958622 方法2.1 DNA 的提取 鸡蛋花及其混伪品药材样本取花瓣约 35 mg,原植物样本取叶片30 mg,用组织研磨仪(Sceintz-48, 宁波新芝)研磨100 s,加入1 mL核分离液(2%PVP, 20 mmol?L-1EDTA, 100 mmol?L-1 pH 8.0 Tris-HCl 和 0.7 mol?L-lNaCl)清洗3〜5次至粉末颜色变浅，然后用植物基 因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.)提取总DNA。

详细操作步骤参见中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则［24］ 及试剂盒说明书2.2 PCR扩增及测序 序列扩增选用ITS2通用引物ITS2F (5/ -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 )和 ITS3R (5/ -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3 ), PCR 扩增体系和程 序参考文献［18］方法进行 PCR 扩增产物经过纯化后使用 ABI 3730 测序仪进行双向测序 2.3 数据处理 运用CodonCode Aligner 软件进行测序峰图校对和序列拼接,采用 基于隐马尔科夫模型的 HMMer 注释方法去除 5.8S rRNA 和 28S rRNA 区［25］,获得完整的 ITS2 序列然后,应用相似 性搜索法(BlastN)进行序列比对分析，MEGA5.1中的K2P (Kimura 2-parameter, K2P)模型进行遗传距离分析，邻接 (NJ)法构建分子系统进化树［26］3 结果3.1 鸡蛋花及其混伪品的 ITS2 序列信息 本研究共涉及 ITS2 序列 50 条，包括鸡蛋花20 条，木棉10 条，凌霄8 条， 美洲凌霄 7 条，鸡冠刺桐 3 条和硬骨凌霄 2 条，分析其 ITS2 序列长度、GC含量及种内变异位点（表2）。

鸡蛋花不同来 源20份样本的ITS2序列长度均为244 bp,种内存在5个变 异位点，位置分别为 28， 34， 48， 83， 84 bp 处，分为 6 种 单倍型，依照序列条数的多少依次命名为H1〜H6（haplotypel〜6）其中H1单倍型样本8个，同KJ419282； H2 单倍型样本 6 个，同 KJ419287；H3 单倍型样本 2 个，同 KJ419293； H4 单倍型样本 2 个，同 KJ419298； H5 和 H6 单 倍型样本各1个，分别为KJ419289和KJ419292 （表3）3.2 鸡蛋花种内及其与混伪品种间遗传距离分析 基于K2P 模型计算遗传距离，结果表明鸡蛋花 ITS2 序列种内的 平均遗传距离为 0.007 6，种内最大遗传距离为 0.016 6进 一步分析鸡蛋花与混伪品的种间距离，结果显示鸡蛋花与木 棉、凌霄、美洲凌霄、鸡冠刺桐和硬骨凌霄间的种间最小遗 传距离分别为 0.392 4， 0.320 8， 0.320 8， 0.635 9， 0.368 2， 均远大于鸡蛋花种内最大遗传距离（表 4），证明 ITS2 序列 能够准确区分鸡蛋花药材与其混伪品。

3.3 鸡蛋花与其混伪品的 NJ 树鉴定 从鸡蛋花及其混伪 品的 50 条 ITS2 序列中选取不同单倍型序列共 13 条，构建 分子系统进化 NJ 树鉴定结果表明，鸡蛋花独自聚为一支， 表现出良好的单系性，与其混伪品能够很好区分（图1）因 此，应用 ITS2 条形码能够准确地鉴别凉茶鸡蛋花与其混伪 品4 讨论 鸡蛋花作为我国岭南地区地方药材被广泛使用在凉茶 制品中该药材为引入品种，在我国的栽培种主要为 P. rubra， 市场上很难出现同属近缘的混伪品然而由于干燥花容易褐 化且易碎，导致其易与木棉花、凌霄花、硬骨凌霄和鸡冠刺 桐等花类混淆，造成鸡蛋花药材出现混伪这些花性味功效 均不同，严重影响鸡蛋花的使用安全性ITS2序列作为药用 植物的通用条形码，已经成功应用于蔷薇科［27］、卷柏科［28］ 以及石斛［29］、麻黄［30］、羌活［31］、灯心草［32］、枸杞子［33］ 等中药材及其混伪品的鉴定研究中鸡蛋花药材与上述混伪 品属于不同科属，理论上用 ITS2 条形码具有很好的鉴定能 力本研究收集鸡蛋花及其混伪品的药材样本，同时采集经 专家鉴定的基原物种样本作为标准，选用ITS2作为DNA条 形码对鸡蛋花及其混伪品进行鉴定研究。

由于这些花类药材 均为褐化的干燥花瓣，因此，在提取花类药材DNA时，首 先对已经研磨好的药材样本进行核分离液洗涤处理，每次加 入 1 mL 核分离液，轻轻混匀洗涤 2 min ，然后离心弃上清， 反复3〜5次后即可使样品颜色变浅，避免由于色素残留影 响 PCR 效率结果表明采用 ITS2F/ITS3R 通用引物能够很好 地扩增并测序获得样本的ITS2序列，证明选用ITS2序列鉴 定鸡蛋花及其混伪品具有很好的稳定性遗传距离和进化树 的分析结果表明，ITS2序列能够准确地区分凉茶药材鸡蛋花 及其混伪品因此，本研究再次证明了 ITS2条形码在药用 植物中良好的鉴别能力，同时为鸡蛋花药材的混伪鉴别提供 了一种新手段，为实现其使用安全和规范市场奠定了分子基 础值得一提的是，本研究还发现ITS2序列同样能够很好 地鉴别区分紫葳科的药材凌霄与其混伪品硬骨凌霄然而凌 霄花药材的基原物种凌霄与美洲凌霄基于ITS2序列仍不能 很好区分，进一步分析发现这2个物种的psbA-trnH序列也 一致因此，针对个别药用植物的特殊性，可能还需筛选更 多的分子标记或者设计特异分子标记作为中药材 DNA 条形 码分子鉴定体系的补充和完善。

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