具杀虫活性雷公藤内生菌F4

具杀虫活性雷公藤内生菌F4-20发酵条件优化研究雷公藤(Ttipterygium wilfordii Hook.f.)为木质藤本植物，系卫矛科雷公 藤属，具有良好的农用活性和医药价值由于雷公藤能产生一系列有生物活性的 物质，包括雷公藤甲素、雷公藤生物碱等，近二十年来国内外对雷公藤进行广泛的 研究在医用资源的竞争和雷公藤植物本身繁殖速度缓慢的两重压力下，雷公藤生 物碱杀虫剂的资源问题显得更加突出雷公藤的需求量越来越大，大量的雷公藤 野生资源被破坏,寻找到能大量产生雷公藤次生代谢产物的材料就成为了当务之 急本研究从分离自雷公藤根部的一株内生菌(F4-20)入手，通过HPLC、 LC-MS/MS证实次级代谢产物中含有雷公藤吉碱，并对内生菌培养发酵条件进行 了优化，以期提高其杀虫活性和雷公藤吉碱含量,为其工业化发酵生产作准备现 将结果总结如下：1 .在不同温度、初始pH、碳源、氮源和生长素的条件下，通过 检测菌落生长的情况，对F4-20菌株固体培养条件进行了优化结果表明,F4-20固体培养的最适温度为20°C;不同碳源培养基中，以葡萄糖 作为碳源时菌落生长最快，培养20 d后菌落直径为4.47 cm;不同氮源培养基中, 豆粉作为氮源时菌落生长最快，培养20 d后菌落直径为5.54cm;培养基的最佳初 始pH值为8.5,最佳生长素为萘乙酸(NAA)。

2.采用高效液相(HPLC)与液相色谱- 质谱/质谱联用(LC-MS/MS)检测，结果显示,F4-20的次级代谢产物中含有雷公藤 吉碱采用E培养基(ISP2),F4-20次级代谢产物中，雷公藤吉碱(wilforgine)的含 量可达44.2仇g/g3.以杀虫活性与菌丝干重为指标，对F4-20菌株发酵培养的 基础培养基进行了筛选结果表明,培养基H为F4-20菌株的最佳基础培养基，培养7 d后,菌丝干重 达8.89 mg/mL,菌丝提取物对3龄蚊幼和月季长管蚜的杀虫活性分别为95.67% 和58.34%;在基础培养基H的基础上,通过单因素试验对发酵培养基的最佳碳源 和氮源进行了筛选结果表明，葡萄糖和蛋白胨为F4-20菌株发酵培养的最佳碳 源和氮源;在最佳碳源和氮源筛选的基础上，以菌丝干重为指标，采用响应面分析 法对F4-20菌株的发酵培养基进行了优化，结果表明，当葡萄糖为35.7 g/L、蛋 白胨26 g/L、七水合硫酸镁0.059 g/L、氯化钠2.38 g/L、磷酸二氢钾1.19 g/L、 碳酸钙2.38 g/L、硫酸铵2.97 g/L时，最有利于F4-20菌株的生长，发酵7d后, 菌丝干重可达13.05mg/mL。

在此基础上，以菌丝干重为指标，利用响应面分析法对F4-20菌株的摇瓶发 酵条件进行了优化结果表明,F4-20菌株摇瓶发酵的最佳条件为，转速 140rmp/min,初始pH 7.5,接种量9.04%,装液量94.2 mL/250mL,在此条件下，培 养7 d后菌丝干重到最大值15.93 mg/mL4.F4-20菌株在ISP2培养基发酵培养的过程中，添加MeJA、SA、H202、GSH 四种诱导子，测定外源诱导子对F4-20菌株生长和雷公藤吉碱产生的影响结果 表明,MeJA、H202、SA有不同程度的抑制生长作用，而添加GSH后显著促进生长添加3 mM的GSH处后，菌丝的鲜重最大(4.72±0.40g),为对照的1.39倍 (3.40±0.07 g)添加MeJA、GSH,雷公藤吉碱在F4-20菌丝体含量有所降低，但 加入H202、SA经诱导含量增高添加100p的SA后，雷公藤吉碱可达45.91±1.26 g,为对照的1.42倍 (32.39±2.61 p g/g)5.内生菌F4-20在5 L、15 L及70 L发酵罐中进行了发 酵培养，结果表明，不同的搅拌转速、通气量和发酵罐工称容积对雷公藤内生菌 F4-20的生长代谢有较大影响。

在5L发酵罐中，搅拌速度200 rpm/min、通气量2.5 L/min时,有利于F4-20 的生长和代谢，在此条件下发酵10 d,菌丝干重为12.94 mg/mL;菌丝干样浓度为 0.15 g/mL时,对月季长管蚜的杀虫活性为56.61%在15L发酵罐中，搅拌速度 200 r/min、通气量10 L/min，采用发酵培养基和ISP2培养基发酵培养时,菌丝 干重分别为6.02 mg/mL、2.02 mg/mL;菌丝干样浓度为0.15 g/mL时，对月季长 管蚜的杀虫活性分别为47.09%和52.87%在70L发酵罐中，搅拌速度150rmp/min、通气量40L/min时,菌丝干重为2.43 mg/mL,菌丝干样浓度为0.15 g/mL时,对月季长管蚜的杀虫活性为37.57%6.通 过PCR技术对F4-20菌株16SrDNA全序列进行扩增并测序，将此序列与GenBank 中该类菌部分已知种的16SrDNA序列进行同源性比较，通过构建的系统发育树， 发现该株菌与链霉菌Blastomycetica strain NRRL B-5480具有高度同一性(98%)结合前期生理生化等特征的鉴定结果，确定F4-20属于放线菌链霉菌属的菌 株。