尤文肉瘤细胞总RNA修饰的树突状细胞的体外培养及其鉴定(一)

尤文肉瘤细胞总 RNA修饰的树突状细胞的体外培养及其鉴定 (一)作者：王剑，桑宏勋，王臻，郭征【关键词】树突细胞；肉瘤 ,Ewing；总 RNA；逆转录聚合酶链反应；癌症疫苗【 Abstract 】AIM:ToinvestigateRNAexpressionofdendriticcells(DC)pulsedwithtotolRNAfromEwingsarcomacells.METHODS:DCwasgeneratedfromtheperipheralbloodmononuclearcells(PBMC)ofEwingsarcomapatients.SurfacemarkersofmaturedDCswasdetectedbyflowcytometer(FCM).TotalRNAwasisolatedfromEwingofDCtansfectedwithtotalRNAwasmeasuredbyRTPCRmethod.RESULTS:SurfacemarkersofDCpulsedwithtotalRNAchangedapparently.CD40increasedfrom32.24%to72.32%.CD83increasedfrom17.39%to30.97%,whilemonocyteCD14declinedfrom26.37%to10.46%.ThisindicatedthesignificantreinforcementofantigenpresentationofDC.RTPCRshowedthespecificsequenceEWSFLI1ofEwingsarcomacanbecombinedwiththeprimerspecificallyatthebesttemperatureof54℃.CONCLUSION:DCpulsedwithtotalRNAofEwingsarcomacellscanpresenttumorspecificantigenandexpressitscharacteristicsequenceEWSFLI1specifically.【 Keywords 】dendriticcells;sarcoma,Ewings;totalRNA;reversetranscriptasepolymerasechainreaction;cancervaccines【摘要】目的：探讨树突状细胞（ DC)经尤文肉瘤细胞总 RNA加载后的体外 RNA表达情况 .方法：采用分离尤文肉瘤患者外周血单核细胞体外诱导 DC,用流式细胞仪检测 DC成熟后的表面标志， Trizol 法提取患者尤文肉瘤组织总 RNA,用总 RNA转染 DC，用 RTPCR方法检测肿瘤总 RNA 加载的 DC的表达 .结果：经尤文肉瘤总 RNA加载的 DC表面标记发生明显变化， DC 的特异性表面标志如 CD40 由 32.24%增高至 72.32%,CD83由 17.39%增高至 30.97%,而代表单核细胞的 CD14 则由 26.37%下降至10.46%，标志其抗原呈递功能显著增强 .RTPCR测定显示尤文肉瘤中的特异性序列 EWSFLI1可以和引物特异性结合， 并且最佳结合温度为 54℃. 结论：尤文肉瘤细胞总ＲＮＡ转染的 DC可以呈递肿瘤特异性抗原， 并特异性的表达其特有序列 EWSFLI1.【关键词】树突细胞；肉瘤， Ewing；总 RNA；逆转录聚合酶链反应；癌症疫苗0 引言细胞毒性 T 淋巴细胞 (cytotoxicＴlymphocytes,CTL)能够介导特异性免疫应答 ,引导特异性肿瘤细胞杀伤效应 .CTL的特异性免疫应答依赖于肿瘤抗原的存在 ,肿瘤抗原被抗原呈递细胞 (antigenpresentingcell,APC)识别吞噬后 ,在抗原递呈细胞内加工处理形成特定的多肽片段 ,与 MHCＩ类分子完全匹配后递呈到细胞表面 ,被相应Ｔ细胞受体 (Tcellreceptor,TCR)识别 ,形成肿瘤抗原多肽 MHCTCR复合物 ,在协同刺激因子的共同作用下 ,激活特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞 ,产生免疫反应、清除肿瘤细胞〔 1〕 .树突状细胞（dendriticcells,DC)是体内最重要的专职抗原递呈细胞 〔2〕,可由骨髓干细胞、外周血干细胞及外周血单个核细胞在细胞因子作用下诱导扩增 .95%的尤文肉瘤家族具有特异的染色体异位 ,从而形成的EWSFLI1融合基因是尤文肉瘤家族发生、进展的主要原因〔 3〕.本研究从尤文肉瘤患者外周血中分离单个核细胞在IL4 和GMCSF诱导下分化扩增DC,从患者尤文肉瘤组织中提取肿瘤总RNA加载DC,并对经总RNA加载后的 DC进行鉴定，确定经肿瘤 RNA加载的 DC持续表达相应特异性肿瘤抗原 ,为 DC 在尤文肉瘤生物学免疫治疗中的临床应用提供实验依据 .1 材料和方法1.1 材料 RPMI1640(美国 GIBCO公司,14.1g/ 包)；胎牛血清（杭州四季青 ,250mL/ 瓶 ） ； IL4 （ 美 国 R ＆ D 公司,lot#AG131091,14.45 ×105U/5ug/mLstock）；rhGMCSF（海南通用同盟药业有限公司 ,150ug/支）；Trizol(美国 GIBCO公司 )；OligodT(美国 GIBCO公司 )；血细胞分离机 (瑞典 GAMBRO.BCT)；梯度 PCR仪(德国 Eppendorff公司 )；流式细胞仪 (美国 BeckmanCoulter 公司 )；尤文肉瘤瘤体标本由第四军医大学西京医院骨科 2005 年收治患者自愿提供 （已签知情同意书）；PCR引物由北京三博生物技术公司合成正向序列为 5＇CCACTAGTTACCCACCCCAAACTG3＇， 反 向 序 列 为 3 ＇GTGATACAGCTGGCGTTGGCG5＇.1.2 方法尤文肉瘤细胞总 RNA 提取手术无菌切除活力好的尤文肉瘤组织，将其平均切成 1mm3 大小的组织块，研磨后加 Trizol2mL消化 2h,将消化好的细胞裂解液吸入 2mL 装的离心管中，加氯仿 0.2mL，静止 2min，然后进行离心，离心设定为：8160g,4℃,15min,取上清无色水相 0.8mL，装入新的 2mL 装的离心管中，加 0.5mL 异丙醇，静置 10min，然后再次离心，离心设定为： 8160g,4℃， 10min,观察总 RNA为管底的白色沉淀，用 DEPC水溶 RNA，并测 RNA 浓度为 4μg/ μL.的体外培养利用血细胞分离机（分离管道：去除白细胞装置管路；分离程序： MNC 程序）采集尤文肉瘤患者外周血中的单个核细胞 . 将获得的单核细胞移入 6 孔培养板内进行贴壁培养，密度为 :1 ×108/孔,培养液为： RPMI1640(10g/LL谷氨酰胺 ,10g/L 非必需氨基酸 ,10g/L 丙酮酸钠 ,100mL/L 胎牛血清 )，37℃,50mL/LCO2孵箱贴壁 2h,后用 PBS洗涤液洗去未贴壁的细胞（大部分为小的淋巴细胞） ，然后加新鲜培养液：RPMI1640＋IL4(800U/mL)＋GMCSF(800U/mL)，37℃,50mL/LCO2孵箱中继续培养 6d，第 2 日和 4 日更换新鲜培养液： RPMI1640＋ IL4(800U/mL)＋GMCSF(800U/mL).总 RNA加载 DC在 DC培养的第 5 日，在实验组中以 10mg/L 的比例加入总 RNA,放入孵箱中培养过夜 .在 DC培养的第 6 日，在对照组中不加入总 RNA进行加载 .的成熟诱导预先在两个 100mmPetri 培养皿中分别接种 5× 107的单个核细胞，2h 后吸弃其中的非黏附细胞 ,37℃,50mL/LCO2继续培养24h ， 收 集 上 清 即 为 成 熟 DC 条 件 培 养 液(preparationofmonocyteconditionedmedium,MCM) ， 在实 验组 中加 入MCM，放入孵箱继续培养 36h，在对照组中部分加入 MCM，部分则不加 MCM.总 RNA加载 DC的鉴定培养前后 DC表面标记的测定收集实验组和对照组两组细胞各分成 5 小组，每小组再分成 6 等份，用 PBS调成 5×105/10 μL，加入 FITC标记的 mAb(CD14,CD40,CD83,CD86,HLADR),4℃避光染色 1h,续加二抗，4℃避光染色 1h，洗涤后用 10mL/L 多聚甲醛固定 ,流式细胞仪分析 .总 RNA加载 DC的 RTPCR测定 RTPCR检测分为 3 组：取 3 个 PCR 小管，设为 a,b,c，各加入 2μLOLigodT,然后在 3 个小管中分别加入 2μL.a: 经肿瘤总 RNA加载的 DC总 RNA;b:未经肿瘤总 RNA加载的 DC总 RNA;c:肿瘤组织的总 RNA.紧接着 3 管均补水至 11μL，70℃,5min，快速入冰中5min， 室 温 离 心8160g.继续 在3 管 中各 加 入5× buffer5μ L,dNTP(10mm/mL)2.5μ L,AMVRT(10u/n)1.5水μ5L,DEPCμ使.总体系达到 25μL，然后将 3 个小管置于 42℃1h，即成 cDNA.将以上三种 cDNA 置于梯度 PCR仪上进行 PCR检测，设定：退火温度 94℃，解链温度： 56.5℃,延伸温度： 72℃.共 35 个循环 .最后对 RTPCR产物再进行琼脂糖凝胶电泳 .统计学处理：数据以 x±s表示，应用 SPSS8.0统计软件采用 t 检验进行数据分析， P0.05 为有统计学意义 .。