微生物检验作业作业指导书.

1 目的通过对微生物检测流程的规范确保检验工作有序进行2 范围 适用于微生物检测的全过程3 职责3.1 检验人员严格按检测流程做好各项工作3.2 检测主管做好监督检查工作4 内容4.1 准备工作4.1.1 卫生清洁 整理普通检验室内的各类检验物品，检查工作台面和地面卫生4.1.2样品收集登记4.1.2.1与收样员沟通，确定检样品种、数量（如仓库到货的茶原料、内包膜，车间生产的半成品、成品，研发样品，采购样品，稳定性试验的样品、定期跟踪检测的样品）4.1.2.2与质保员沟通，确定检样品种、数量（如自来水、纯水、一楼生产过程跟踪的各阶段液体）4.1.2.3 按检测计划自行确定的检样品种、数量（如工作间空气、设备内表面、员工手部）4.1.2.4各项确定后，收集并登记样品4.1.3检测方法的确定4.1.3.1样品收集后进行分类，确定样品的检测方法，若无方法的要尽快上报或查找相关方法4.1.3.2微生物各项目所采用的检测方法（见附表1）4.2 试剂配制、物品包扎4.2.1玻璃容器的包扎：灭菌前器皿应包扎紧密完整后才进行灭菌，以防止灭菌后器皿受到污染4.2.2平皿、吸管按量分成若干单元用牛皮纸、报纸包扎；4.2.3试管及三角瓶应塞硅胶塞，在瓶口再用报纸包扎；4.2.4其它玻璃或金属取样工具也要用报纸包扎；4.2.5生理盐水按氯化钠加水比例0.84%配制；平板计数琼脂（PCA）、孟加拉红、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）则以标签上规定的比例进行配制。

按需要量分装成于不同规格的容器中4.3 高压灭菌4.3.1培养基及器皿的灭菌：4.3.1.1高压蒸汽灭菌：金属器具、玻璃器皿、基础培养基及其它耐热物品均放入锅内灭菌4.3.1.2灭菌参数：121℃(0.1034MPa)，15~20min；4.3.2染菌培养物：121℃(0.1034MPa),30min;4.3.3含糖类不耐热培养基(按试剂要求)：115℃（0.0727MPa）,15~20min4.3.4每次灭菌时均须将灭菌指示带置于灭菌锅内，观察灭菌效果4.3.5灭菌锅的使用：参照“仪器使用维护保养作业指导书”的相关内容执行4.4 烘干高压蒸汽灭菌后的物品除培养基及稀释液外的其他物品，如玻璃平皿吸管、金属器具或棉花等均应先置于105℃烘箱内，根据包装大小应保持1h以上，至干燥后使用4.5贮存4.5.1灭菌后处理：灭菌后物品，注意放置场所，严禁与未灭菌物品混放,以免再度污染4.5.2灭菌合格的培养基及稀释液先贮存于消毒柜，臭氧消毒并低温烘干瓶口包扎纸，存放一般不超过24h，当天未使用完的置于4℃冰箱存放，3天内使用完培养基及稀释液的配制数量应以适量为宜4.5.3烘干后合格的灭菌物品应存放于贮藏室或消毒柜内,灭菌后保存最长不得超过3天。

4.5.4包装损坏或塞子脱落者，不可作为无菌品使用4.6 无菌室的消毒4.6.1超净台的使用4.6.1.1使用前应先用75%酒精棉擦拭台面，再打开超净配备的紫外灯，照射时间不少于30min；4.6.1.2使用时,应关闭紫外灯,打开日光灯,同时打开无菌风直至实验结束；4.6.1.3超净台灭菌效果应以落菌实验加以验证；4.6.2无菌间使用前后应将门关紧，打开悬吊式紫外灯消毒，应选用30W,距离在1．0m处，照射时间不少于30min；4.6.3缓冲间的使用：微检员工作时穿的衣帽、鞋等物品需放置在缓冲间并于实验前后打开紫外灯，照射时间不少于30min4.7 检测过程4.7.1操作过程要求无菌；4.7.2进入缓冲间后用75%的酒精棉球消毒双手，换上已消毒的专用工作服、帽、口罩及鞋；4.7.3接种样品时，应再用75%的酒精棉球消毒双手；4.7.4检品须称量的要保证重量准确，且要尽快加入至稀释液中；4.7.5检样液瓶口应尽快塞紧硅胶塞，将其样液充分摇匀；4.7.6从包装中取出吸管时，尖端不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖端不得触及试管或平皿；4.7.7接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰灭菌。

接种环和接种针在接种细菌前后应经火焰灼烧全部金属丝，必要时要烧到环和针的连接处火焰灭菌的有效范围以火焰为中心半径9cm内4.7.8倾倒培养基至平皿中摇匀放置；4.7.8检品检测完毕时，要求做空白对照；4.7.9不同检品要根据各自特性综合考虑，如选择的检测项目、稀释度等（附表1的相关内容）；4.7.10打开包装未使用完的器皿，放置后再使用应重新灭菌；4.8 记录 按检品的种类、检测项目、稀释度进行登记，注明编号4.9培养4.9.1冷却后的平板及已接种的稀释培养液（如菌落总数、大肠菌群）置入37℃恒温培养箱培养48h；4.9.2冷却后的平板（如霉菌）则置入28℃恒温培养箱培养5天；4.9.2培养温度时间按不同检测项目进行确定，置入前均须检查培养箱温度是否符合要求4.10 结果报告4.10.1按品种、检测项目查记录后，确认达到规定培养时间的培养物，取出进行计数；4.10.2计数方法按附录1中不同检测项目规定的内容执行；4.11 清洗4.11.1器皿的清洗：凡被污染的器皿，应先经过121℃，30min高压蒸汽灭菌后再进行清洗4.11.2日常使用后的容器、平皿等经水冲洗或超声波清洗干净4.11.3清洗后要求烘干或晾干备用。

4.12 卫生清洁消毒 按《化验室卫生管理制度》、《微生物检定室管理制度》的相关内容执行5 卫生检测5.1微生物涂抹实验5.1.1实验试剂：0.84%灭菌生理盐水；5.1.2实验仪器：试管、灭菌镊子、灭菌棉球：体积为3×3×3cm3、酒精灯5.1.3 准备工作：配制0.84%生理盐水分装在一定数量试管中，每管10ml，灭菌后待用；5.1.4 样品采集：5.1.4.1 设备及容器具取样： 在酒精灯火焰上方，以无菌镊子镊取无菌棉球沾润灭菌生理盐水，反复擦拭需采集样品物体表面约30cm2，然后将该棉球迅速装入盛有10ml的灭菌生理盐水试管中，摇匀待用；5.1.4.2内包装材料取样： 在酒精灯火焰上方，以无菌镊子镊取无菌棉球沾润灭菌生理盐水，以无菌操作方式于无菌操作台内反复擦拭内包装材料表面，再将擦拭后的棉球装入盛有10ml的灭菌生理盐水试管中，摇匀待用；5.1.4.3操作人员手菌取样：在酒精灯火焰上方，以无菌镊子镊取无菌棉球沾润灭菌生理盐水，用此棉球反复擦拭待测人员左手（或右手），然后棉球迅速装入盛有10ml的灭菌生理盐水试管中，摇匀待用；5.1.5 样品检测：将带有检测棉球的生理盐水在微生物无菌室按4中相关内容操作。

5.1.6 计算方法：5.1.6.1设备、容器具与内包装材料（涂抹法）：菌落总数（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数×10/305.1.6.2：人员手部（涂抹法）：菌落总数（cfu/只手）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数×10/25.2 落菌实验5.2.1实验试剂：营养琼脂；5.2.2实验仪器：平皿、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱5.2.3 实验步骤：5.2.3.1 在微生物检验室内将灭菌好的凉至45℃左右的营养琼脂倒入灭菌平皿内，每皿约15-20ml，待琼脂凝固后，将平皿翻转，待用；5.2.3.2 生产车间环境落菌检测的操作方法： 生产车间灭菌后或生产进行中进行测试将5个装有营养琼脂的培养皿（直径为9cm）,放置于所测车间的四个角落以及中间处,测试时间为30min,然后将平皿盖好取回,放入培养箱内培养,同时做空白实验;5.2.3.3将其在37±1℃的环境下培养48h,平皿上所长菌落数即该环境的菌落数6 其它6.1查找检验用文件，分析检验工作中存在的问题；6.2清点本身检验有关的物品，提出领用或申购，满足检验。